旋毛虫虫种核酸鉴定专家共识（2025）

Expert consensus on species identification of Trichinella spp. by nucleic acid method

ZHANG Xi^{1}, CUI Jing^{1}, LIU Ruodan^{1}, LONG Shaorong^{1}, CHEN Muxin^{2}, CHEN Jiaxu^{2}, FU Baoquan^{3}, LIU Xiaolei^{4}, LIU Mingyuan^{4}, ZHANG Yalan^{5}, ZHANG Hongwei^{5}, WANG Zhongquan^{1*}

1 Department of Pathogen Biology, School of Basic Medical Sciences, Zhengzhou University, Zhengzhou 450001, Henan; 2 National Institute of Parasitic Diseases, Chinese Center for Disease Control and Prevention (Chinese Center for Tropical Disease Research), Shanghai 200025; 3 Lanzhou Veterinary Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Lanzhou 730030, Gansu; 4 Institute of Zoonotic Diseases of Jilin University, WOAH Asia Pacific Collaborative Center for Foodborne Parasitic Diseases, State Key Laboratory for Diagnosis and Treatment of Severe Zoonotic Infectious Diseases, Changchun 130015, Jilin; 5 Henan Provincial Center for Disease Control and Prevention, Zhengzhou 450000, Henan

[Abstract] The larvae of Trichinella nematodes parasite in humans and various vertebrates, which seriously endangers people's health and animal meat food safety. There are numerous species within the Trichinella genus; and the infectivity and pathogenicity of Trichinella spp. larvae are obviously different. In recent years, new Trichinella spe-cies have been discovered consecutively. The available pathogenic examination methods(direct microscopy of biopsy muscles and artificial digestion) could not distinguish the Trichinella species. To provide reference for Trichinella taxo-nomic researches and the accurate diagnosis of trichinellosis, this consensus elaborate on the nucleic acid methods for the identification of Trichinella spp. based on the latest domestic and international research progress.

[Keywords] Trichinella; trichinellosis; Species identification; multiplex PCR; Restriction fragment length polymorphism

Supported by the Intergovernmental International Scientific and Technological Innovation Cooperation Projects of National Key Research and Development Program (2024YFE0199100), the Preliminary Research Project on Health Standardization in the Public Health Sector of the Chinese Center for Disease Control and Prevention in 2022 (BZ2022-Q006) and the National Science and Technology Basic Conditions Platform, National Parasite Resource Database Project (NPRC-2019-194-30)

* Corresponding author, E-mail: wangzq@zu.edu.cn

·2·中国寄生虫学与寄生虫病杂志2025年10月第43卷第5期 Chin J Parasitol Parasit Dis Oct.2025, Vol.43,No.5

1 前言

旋毛形线虫(Trichinella spp.)，简称旋毛虫，其幼虫可寄生于人体及多种脊椎动物引起严重的人兽共患寄生虫病——旋毛虫病(trichinellosis) [1,2]。人类罹患旋毛虫病主要由生食或半食含旋毛虫肌幼虫囊包的肉类所致，该病呈世界性分布，严重危害人体健康和动物肉类食品安全[3]。我国是旋毛虫病重度流行区，除海南省以外的其他省(直辖市、自治区)均有旋毛虫分布，时常出现局部的旋毛虫病暴发[4]。旋毛虫种类繁多，不同虫种对外界低温的抵抗力、对宿主的感染性和致病性、在不同宿主体内的繁殖力等方面存在明显差异。因此，旋毛虫的虫种鉴定是旋毛虫病精准诊断和防治的基础，并可为旋毛虫病暴发时的疫情处置提供技术支撑[5-6]。目前，现有的病原学检查方法(肌肉活检压片或人工消化法)在形态上不能区分旋毛虫虫种[7]。对于旋毛虫的虫种鉴定与基因分型，国际旋毛虫病委员会(International Commission on Trichinellosis，ICT)推荐使用核酸鉴定方法[8]。为了推动旋毛虫的虫种鉴定和旋毛虫病诊断工作规范有效地开展，郑州大学病原生物学系联合国内同行专家，共同参与形成了《旋毛虫虫种核酸鉴定专家共识(2025版)》。希望该共识能适用于各级疾病预防控制机构、医疗机构以及动物疫病防控机构对旋毛虫检测和虫种鉴定，能有效提升我国动物旋毛虫感染的检验检疫水平和旋毛虫病的防治水平。

2 旋毛虫分类现状

旋毛虫隶属于线虫动物门(Nematoda)、刺嘴纲(Enoplea)、毛形线虫目(Trichinellida)、毛形线虫

科(Trichinellidae)、毛形线虫属(Trichinella)，国内常称为旋毛虫属。目前旋毛虫属已鉴定出10个种和3种基因型，可感染150多种哺乳动物、鸟类和爬行动物[9,10]。在旋毛虫属内，能够感染人体的旋毛虫主要有旋毛虫(Trichinella spiralis，T1)、乡土旋毛虫(T. nativa，T2)、布氏旋毛虫(T.britovi,T3)、伪旋毛虫(T. pseudospiralis，T4)、旋毛虫基因型T9、巴布亚旋毛虫(T. papuae，T10)等。旋毛虫不同种与基因型及其宿主来源和分离时间见表1，其分类特征如下[11-13]

2.1旋毛虫(T. spiralis), T1)

旋毛虫是引起人和家养动物旋毛虫病的主要病原体，全球性分布。主要生物学特征为:①在大鼠与小鼠、家猪与野猪体内的生殖力指数(reproductive capacity index, RCI)最高;②雌虫子宫长度与感染指数密切相关，子宫越长产幼虫能力及感染指数越高;③雌虫在体外的新生幼虫产量均高于旋毛虫的其他虫种与基因型;④营养细胞与胶原囊发育速度最快;⑤所有宿主肌肉中的幼虫对低温的抵抗力较低。人体感染此种旋毛虫的主要来源是家猪和野猪肉，在北美与欧洲除野猪肉外，还有熊肉、马肉和狐肉等。

2.2乡土旋毛虫(T.nativa,T2)

乡土旋毛虫，亦称北方旋毛虫或固有旋毛虫，是全北区的北极和亚北极地区野生动物旋毛虫病的主要病原体。多种食肉动物(熊、狐、狗、野猪、马、猫科动物、海象及海豹等)可作为其宿主，对家猪和鼠类的感染性低。主要生物学特征为:①子宫长度明显小于T1及T7;②在大鼠、小鼠、家猪与野猪体内的RCI较低;③食肉动物肌肉内的幼虫

表1旋毛虫属各虫种或基因型及其宿主来源和分离时间

|旋毛虫种/基因型|*ISS编码|宿主来源|国家|分离年份| |---|---|---|---|---| |旋毛虫(T. spiralis, T1)|ISS3|野猪(Sus scrofa)|波兰|1960| |乡土旋毛虫(T. nativa, T2)|ISS10|北极熊(Ursus maritimus)|挪威|1984| |布氏旋毛虫(T. britovi, T3)|ISS120|赤狐(Vulpes vulpes)|意大利|1988| |伪旋毛虫(T.pseudospiralis, T4)|ISS13|浣熊(Procyon lotor)|俄罗斯|1972| |穆氏旋毛虫(T. murrelli, T5)|ISS417|草原狼(Canis latrans)|美国|1989| |基因型T6(Trichinella, T6)|ISS34|灰熊(Ursus arctos horribilis)|美国|1983| |纳氏旋毛虫(T. nelsoni, T7)|ISS37|疣猪(Phacochoerus aethiophicus)|坦桑尼亚|1982| |基因型T8(Trichinella, T8)|ISS272|非洲狮(Panthera leo)|纳米比亚|1992| |基因型T9(Trichinella, T9)|ISS409|貉(Nyctereutes procyonoides)|日本|1984| |巴布亚旋毛虫(T. papuae, T10)|ISS1980|人(Homo sapiens|泰国|2007| |津巴布旋毛虫(T.zimbabensis,T11)|ISS1029|尼罗鳄(Ncrocdylus niloticus)|津巴布韦|1995| |巴塔哥尼亚旋毛虫(T. patagoniensis, T12)|ISS2496|美洲狮(Puma concolor)|阿根廷|2008| |羌查旋毛虫(T.chanchalensis, T13)||狼獾(Gulo gulo)|加拿大|2020|

注:*ISS，罗马高级卫生研究所。

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对低温的抵抗力强，比其他种旋毛虫约高10倍。该虫是北极地区人体旋毛虫病的主要病原体，当地居民主要因食海象肉、熊肉及其他野生动物肉类而感染，在法国和美国已有多起因食入含有该虫的马肉和美洲狮肉引起的旋毛虫病暴发。临床特点是潜伏期长和具有严重的胃肠道症状。

2.3布氏旋毛虫(T.britovi,T3)

布氏旋毛虫在欧洲、亚洲及非洲均有分布。野生食肉动物(狐、豺、狼、野猪等)是其主要保虫宿主，偶可感染马、家猪及人体。在欧洲是野生动物旋毛虫病的主要病原体。虽然家养动物也可感染该虫，但由于其在家猪及鼠类体内的生殖力低，不能维持其家养动物循环。主要生物学特征为:①在大鼠与小鼠、家猪与野猪体内的RCI低于T1，但高于T2;②肌幼虫对低温抵抗力高于T1，但低于T2;③对大鼠的感染性低而对家猪的感染性为中度;④营养细胞发育缓慢;⑤新生幼虫体外产量较低。人体感染该虫主要因生食或半生食野猪肉、马肉、散养的家猪肉以及红狐肉和豺肉等，在欧洲一些国家，布氏旋毛虫已成为引起人体旋毛虫病的主要虫种。临床上潜伏期长，症状轻度到中度，无胃肠道症状，目前无死亡病例报道。

2.4伪旋毛虫(T. pseudospiralis，T4)

伪旋毛虫在古北区、新北区和大洋洲广泛分布。主要生物学特征为:①在光镜下肌幼虫周围无胶原囊;②宿主范围广泛，可感染捕食性和杂食性鸟类及哺乳动物(有袋目、啮齿类、食肉类动物、猪及人类)，在北美与欧洲主要感染野猪，偶尔感染山猫与红狐，可实验感染鸡和鹌鹑;③成虫、新生幼虫与肌幼虫均小于旋毛虫的其他种与基因型;④在大鼠与小鼠、家猪与野猪体内的RCI均小于T1，但高于其他种与基因型，在鸟类的RCI低于啮齿动物。1995年新西兰报道了第1例伪旋毛虫病人，随后在泰国、法国及俄罗斯的勘察加半岛发生了3次因食野猪肉引起的伪旋毛虫病暴发，临床表现为中度至重度，发生1例死亡病例。

2.5穆氏旋毛虫(T.murrelli，T5)

穆氏旋毛虫为布氏旋毛虫的姊妹种，仅分布于新北区温带(北美地区)。可感染多种野生食肉动物(熊、狼、红狐、美洲野猫、浣熊和水貉等)及家养动物(犬、马和猫等)，未发现家猪的自然感染。主要生物学特性为:①肌幼虫不耐低温;②对大鼠与小鼠、家猪与野猪的感染性较低，但对自足鼠与鹿鼠有较高的感染性;③在猪体内的生殖力明显低于T3，在大鼠体内的生殖力低;④幼虫周围

的胶原囊形成时间较长;⑤在体外新生幼虫的产量较低。2003年在美国发生了因食黑熊肉引起的穆氏旋毛虫病暴发，在法国已发生2次因食生马肉引起穆氏旋毛虫病的暴发。临床表现为轻度至中度，但严重病例可导致死亡。

2.6旋毛虫T6基因型(Trichinella，T6)

T6基因型分布于美国和加拿大的北极和亚北极地区，可感染野生食肉动物(熊、山狮、狼、狐和狼獾等)，生物学特性和T2类似，可与T2杂交，对低温抵抗力强(低于T2但高于其他种与基因型)，对小鼠与大鼠、家猪与野猪的感染性较低。在美国爱达荷州与加拿大安大略省分别发生了因食含T6幼虫的美洲狮与黑熊肉而引起的人体旋毛虫病。临床表现轻微或中度，无死亡病例。

2.7纳氏旋毛虫(T. nelsoni, T7)

纳氏旋毛虫亦称南方旋毛虫，地理分布仅限于从肯尼亚至南非的非洲东部地区，可感染蝙蝠耳狐、猎豹、豹、狮及斑点土狼等野生动物。主要生物学特性为:①对啮齿动物与家猪的感染性低于T1，但高于T2;②肌幼虫不耐低温，但对高温具有异常高的抵抗力，在56℃可存活60min，而其他种的肌幼虫在此温度下10min内即可被杀死;③子宫长度介于T1和T2之间;④在家猪及大鼠体内生殖力较低，新生幼虫体外产量亦较低;⑤胶原囊形成时间较长。约有100例人体感染，见于肯尼亚、坦桑尼亚、塞内加尔及埃塞俄比亚，临床表现为轻度至重度，有死亡病例。

2.8旋毛虫T8基因型(Trichinella，T8)

T8基因型分离自南非和纳米比亚的野生食肉动物(狮、斑点土狼)，可与布氏旋毛虫杂交，无特异性等位基因酶，主要生物学特性类似于T3和T5。目前尚无人体感染病例的报道。

2.9旋毛虫T9基因型(Trichinella，T9)

T9基因型分离自日本野生食肉动物(貉、日本黑熊及北海道的红狐)，实验条件下可与T3杂交，但其核糖体IST2序列与T5相似。2016年在日本发生了一起因食熊肉引起的旋毛虫病暴发，发病21人，病原体为T9。

2.10巴布亚旋毛虫(T.papuae,T10)[14]

巴布亚旋毛虫是第2个发现的肌幼虫无囊包的旋毛虫。主要生物学特征为:①在光镜下肌幼虫周围无胶原囊;②可感染多种哺乳类与爬行类动物(家猪、野猪、猫、红狐、小鼠和大鼠及饲养的淡水鳄鱼)，但不能感染鸟类和鸡;③在大鼠与小鼠体内的RCI低于T1、T3及T4，但高于成囊型的其

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他种旋毛虫与基因型;④成虫和肌幼虫大小与成囊型的其他种旋毛虫及基因型相似，但明显大于伪旋毛虫，肌幼虫长度比伪旋毛虫长1/3;⑤肌幼虫不耐低温。此外，在35℃环境中保存9d的猪肉中的幼虫仍有感染性。2006-2007年在泰国已发生2起因食野猪肉引起的巴布亚旋毛虫病暴发。

2.11 津巴布韦旋毛虫(T.zimbabwensis,T11) [15]

津巴布韦旋毛虫是第3个发现的肌幼虫无囊包的旋毛虫。主要生物学特征为:①在光镜下肌幼虫周围无胶原囊;②在非洲的自然感染仅见于爬行类动物，可实验感染大鼠、小鼠、仓鼠、狐、猪、猴等，但不能感染鸟类;③成虫和肌幼虫大小与巴布亚旋毛虫相似。目前尚无人体感染病例。2008年7月在台湾省发生了一起因食生龟肉而引起的旋毛虫病暴发，8人发病，病原体可能是T10或T11。

2.12巴塔哥尼亚旋毛虫(T. patagoniensis,T12) ${}^{[16]}$

巴塔哥尼亚旋毛虫分离自阿根廷的山狮体内。主要生物学特征为:①其可与布氏旋毛虫和穆氏旋毛虫杂交，但产生不可育的子代;②相较于啮齿类动物(如小鼠、大鼠等)，巴塔哥尼亚旋毛虫更适宜于在肉食动物(如狮、猫等)体内寄生，且在家猪体内的生殖力指数极低;③较耐低温，在-5℃条件下，在猫肌肉组织中可存活3个月。目前尚无人感染病例。

2.13羌适旋毛虫(T. chanchalensis, T13)[17]

羌查旋毛虫是最新发现的旋毛虫属物种，2020年由Sharma等在加拿大西北部羌查山区(Ch'anchaden mountain)的狼獾肌肉内发现，是成囊型旋毛虫，对低温抵抗力较强，在狼獾体内可存在与T2或T6的混合感染。T13对家猪和小鼠的感染性仍然未知，目前也没有人感染病例。然而，由于T13和T2通常以共感染的形式出现，且使用传统的多重PCR鉴定方法无法有效区分这两个种，之前报道的T2感染可能存在错误鉴定，因此，T13的潜在感染性有待进一步评估。

3 旋毛虫虫种的核酸鉴定

3.1 非 基 囊

旋毛虫虫种鉴定基于的目标基因包括:①ESV(expansion segment V region)，即核糖体延伸片段5区，位于核糖体的第4区域;②ITS1(internal transcribed spacer 1)，核糖体转录间隔区1，位于核糖体 18S与 5.8S之间;③ITS2(internal transcribed spacer 2)，核糖体转录间隔区2，位于核糖体 5.8S与 28S之间;④cox1(mitochondrial

cytochrome c-oxidase subunit I gene),线粒体细胞色素氧化酶I基因;⑤cytb(mitochondrial cytochrome b gene),线粒体细胞色素b基因 ${}^{[18-22]}$ 。其中，ESV、ITS1和ITS2为多重PCR反应体系中的核心基因，cox1用于区分布氏旋毛虫(T3)与旋毛虫基因型T9，cytb用于区分乡土旋毛虫(T2)和羞查旋毛虫(T13)。

3.2 虫体的处理

旋毛虫虫体(幼虫或成虫)在乙醇溶液中冷冻保存，乙醇浓度为95%~100%，保存时间最长为5年;一般选取旋毛虫肌幼虫15~20条。新鲜或冰冻的虫体可直接提取DNA;对于乙醇保存的虫体，需要用PBS冲洗3次后再提取DNA。

3.3 DNA提取和PCR扩增

参考虫株:旋毛虫参考虫株编码按照国际旋毛虫参考实验室提供的ISS编码(表1)。DNA提取:基因组DNA提取采用商品化试剂盒，提取过程中无需去除RNA，PCR过程中出现RNA不影响扩增结果，整个提取过程在室温下进行。

PCR扩增:操作过程中带一次性手套，使用无菌加样器吸头，所有操作在冰上进行;使用参考虫株DNA作为阳性对照，无菌水作为阴性对照;多重PCR3个靶基因(ESV、ITS1和ITS2)的扩增引物见表2，多重PCR的反应条件均为:95℃4min;95℃ 10s,55℃ 30s,72℃ 30s共35个循环;72℃ 3 min;4℃。

3.4 PCR结果判定

PCR产物电泳:取PCR产物5μL与1μL6x加样缓冲液混合，加样于含溴化乙锭替代物(如SYBR green I)的2.0%琼脂糖凝胶中，同时加入15μL DNA标志物DL50;在1xTAE缓冲液中，5 V/cm电泳约40 min，当溴酚蓝到达底部时停止电泳，用凝胶成像系统分析。

PCR结果判定:PCR扩增旋毛虫样品及阳性对照均出现表3中的特异性条带，阴性对照未出现条带，判定为PCR结果阳性;PCR扩增旋毛虫样品未出现表3中的特异性条带，阳性对照出现表3中的特异性条带，阴性对照未出现条带，判定为PCR结果阴性。

3.5旋毛虫虫种/基因型鉴定

3.5.1旋毛虫(T1)鉴定多重PCR体系，扩增出173 bp单一条带，判定为旋毛形线虫(T1)。

3.5.2乡土旋毛虫(T2)鉴定基于多重PCR体体系，扩增出129 bp单一条带，判定为乡土旋毛虫(T2);由于乡土旋毛虫(T2)和巴塔哥尼亚旋毛

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虫(T12)的扩增条带大小仅差2bp，肉眼难以区分，因此，区分这两个虫种需要对其ESV基因扩增产物进行双向测序，根据序列比对结果做进一步区分，T2和T12的ESV序列差异见表4。

3.5.3布氏旋毛虫(T3)鉴定基于多重PCR体系，布氏旋毛虫(T3)、基因型T8和基因型T9均可扩增出129 bp和253 bp两条带，需要做进一步鉴定:①T3与T8的区分需要根据ITS2基因的扩增结果进行判断，当出现1条大小为125 bp的条带时，判定为布氏旋毛虫(T3);当出现1条大小为104 bp的条带时，判定为基因型T8;ITS2基因的扩增引物见表5;此外，根据旋毛虫的地理分布，目前T8只分布于撒哈拉以南的非洲地区，因此只有当旋毛虫样本来源于该地区时，才考虑对它们进行区分。②T3与T9的区则需要基于线粒体细胞色素氧化酶I(cox1)基因的限制性内切酶片段长度多态性方法(restriction fragment length polymorphism,RFLP)进行判断，当RFLP结果出现5个条带(大小分别为22、62、64、70和201 bp)时，判定为布氏旋毛虫(T3);当出现大小分别为92和327 bp

表2旋毛虫属不同虫种鉴定的PCR引物〔18〕

|目的基因|引物编号|引物序列| |---|---|---| |ESV|cp.I-F|5'-GTTCCATGTGAACAGCAGT-3'| ||cp.IR|5'-CGAAACATACGACAACTGC-3'| |ITS1|cp.IIL|5'-GCTACATCCTTTTGATCTGTTT-3'| ||cp.IIL|5'-AGACACAATATCAACCACAGTACA-3'| |ITS1|cp.IIL|5'-GCGGAAGGATCATATCGTGTA-3'| ||cp.IIL|5'-TGGATTACAAAGAAACACTCACT-3'| |ITS2|cp.IV-F|5'-GTGAGCGTATAAAGGCTTGAGC-3'| ||cp.IV-R|5'-TTCATCACATACCTTCCACTA-3'| ||cp.V-F|5'-CAATTGAAACCGCTTAGCGTTT-3'| ||cp.V-R|5'-TGATCTGAGGTCACATTTCC-3'|

的2个条带时，判定为基因型T9;cox1基因扩增引物见表6，RFLP操作步骤见表7;此外，根据生物地理分布，基因型T9目前只在日本有分布，因此只有当旋毛虫样本来源于日本时，才考虑对它们进行区分。

3.5.4 伪旋毛虫(T4)鉴定基于多重PCR体系，扩增带条在292~360 bp范围内，可能出现不同条带数(1、2或3条)，判定为伪旋毛虫(T4)。

3.5.5 穆氏旋毛虫(T5)鉴定基于多重PCR体系,扩增出129 bp和316 bp两个条带,判定为穆氏旋毛虫(T5)。

3.5.6 旋毛虫基因型T6鉴定基于多重PCR体系扩增出129 bp和210 bp两个条带，判定为基因型T6。3.5.7纳氏旋毛虫(T7)鉴定基于多重PCR体系，扩增出155 bp和404 bp两个条带，判定为纳氏

系,扩增出155 bp和404 bp两个条带,判定为纳氏旋毛虫(T7)。

3.5.8旋毛虫基因型T8鉴定参照3.5.3的步骤，首先考虑样本来源，然后采用多重PCR鉴定，并进一步使用ITS2基因进行区分。

3.5.9旋毛虫基因型T9鉴定参照3.5.3的步骤，首先考虑样本来源，然后采用多重PCR鉴定，并进一步使用基于cox1基因的PCR-BFLP方法进行判断。

3.5.10巴布亚旋毛虫(T10)鉴定基于多重PCR体系，扩增出240bp单一条带，判定为巴布亚旋毛虫(T10)。

3.5.11 津巴布韦旋毛虫（T11）鉴定 基于多重PCR体系，扩增出264 bp 单一条带，判定为津巴布韦旋毛虫（T11）。

3.5.12 巴塔哥尼亚旋毛虫(T12)鉴定基于多重PCR体系,扩增出127 bp单一条带,判定为巴塔哥尼亚旋毛虫(T12),其与乡土旋毛虫(T2)的区分,详见3.5.2。

表3旋毛虫种/基因型ESV、ITS1和ITS2基因PCR扩增特异性条带大小

|基因|T1|T2,T13|T3,T8,T9|T4*|T5|T6|T7|T10|T11|T12| |---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---| |ESV|173 bp|129 bp|129 bp|292-360 bp|129 bp|129 bp|155 bp|240 bp|264 bp|127 bp| |ITS1||253 bp||||210 bp||||| |ITS2||125 bp|(31) 104 bp||316 bp||404 bp||||

注:*292~360bp范围内，可能出现多种条带(1、2或3条)。

表4乡土旋毛虫与巴塔哥尼亚旋毛虫ESV基因的序列比对

|旋毛虫|ESV基因序列| |---|---| |乡土旋毛虫|$$\begin{aligned}&\text{GTTCCATGTGAACAGCAGTTGGACATGGGGTCAGTCGATCCTAAAGAAACGGCGAAAGCTTGTCGAATTTGCGACATGAATTG}\\&\text{TAAGACTGTGTG...AATTGTGTGTGTGTGTCAGTTGTGATGTTTTCG(129 bp)}\end{aligned}$$| |巴塔哥尼亚|$$\begin{aligned}&\text{GTTCCATGTGAACAGCAGTTGGACATGGGGTCAGTCGATCCTAAAGAAACGGCGAAAGCTTGTCGAATTTGCGACATGAATTG}\\&\text{TAAGACTGTGTGTTGTGGTGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGGTGG|

注:“-”表示缺失碱基;“黑体+阴影”表示差异碱基。

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3.5.13 羌查旋毛虫(T13)鉴定对于羌查旋毛虫的鉴定,首先考虑其地理来源,目前该种旋毛虫仅存在于北美洲西北寒带、亚寒带地区的狼獾体内,且通常与T2和T6存在混合感染。基于多重PCR体系, T13与T2均扩增出129 bp单一条带,需要基于线粒体细胞色素b基因(cytb)的限制性内切酶片段长度多态性方法(PCR-RFLP)做进一步判断,当RFLP结果出现2条大小分别为507和407 bp的条

表5布氏旋毛虫(T3)和基因型T8的ITS2基因扩增引物[23]

|目的基因|引物编号|引物序列| |---|---|---| |ITS2|ITS2.GF|5'-CCGGTGAGCGTAATAAAG-3'| |ITS2G|ITS2.GR|5'-TACACACAACGCAACGAT-3'|

表6 布氏旋毛虫 (T3) 和基因型T9线粒体cox1基因的扩增引物 ${}^{[24]}$

|目的基因|引物编号|引物序列| |---|---|---| |cox1|L6625.F|5'TYTGGTTYTTCGGKACCCC-3'| |cox1|H7005.R|5'-ACGACGTAGTAGGTTRTCG-3'|

表7 布氏旋毛虫(T3) 和基因型T9线粒体cox1基因的RFLP操作步骤

|步骤|操作内容| |---|---|

1 将至少 100 ng ox1基因扩增产物转移至 1.5 mL Ep管中,加水至 10 $\mu$L

2 加入5μL 10 × Mse 1 反应缓冲液，1 pL Mse 1 (10 U/pL) 限制性内切酶，加水至50μL

3 充分混匀并37℃孵育60min

4 加热至65℃孵育20min以终止反应，并摇晃几秒钟

5取5μL与1μL6×加样缓冲液混合，加样于含溴化乙锭替代物(如SYBR green I)的2.0%琼脂糖凝胶中。在1×TAE缓冲液中，5V/cm电泳约40min，当溴酚蓝到达底部时停止电泳，用凝胶成像系统分析

<EndOfPara>带时，判定为羌查旋毛虫(T13);当出现2条大小分别为537和377 bp的条带时，判定为T2;cytb基因扩增引物见表8，RFLP操作步骤参见表7，将限制性内切酶更换为BsaI和BglIII。

此外，对于不同旋毛虫虫种混合感染的肌肉样本，也可以采用基于ITS1的高通量测序技术进行区分，具有较高的分辨率 $^{[25]}$ ，但该方法需要基于高通量测序设备且操作较为繁琐，目前仍不适合于普通的实验室和检测机构对旋毛虫进行虫种鉴定。

4 旋毛虫虫种鉴定——核酸检测方法流程图(图1)

5 结语

目前，旋毛虫属内的虫种鉴定目前仍主要是基于多重PCR的核酸鉴定方法。然而，旋毛虫属的分类状态一直处于变动之中，随着旋毛虫宿主种类与地理区域调查范围的扩大，以及分类学方法的不断更新，可能会有更多的旋毛虫新种或基因型被发现，届时会出现更新、更完善的旋毛虫虫种鉴定体系。

志谢 首都医科大学诸欣平教授，河南省疾病预防与控制中心许汴利主任医师，西安交通大学赵亚娥教授，东北农业大学宋铭忻教授与路义鑫教授，江苏省寄生虫病防治研究所曹俊研究员，浙江省疾病预防控制中心姚立农主任医师，上海市疾病预防控制中

表8 其美查旋毛虫（T13）和乡土旋毛虫（T2）线粒体cyrb基因的扩增引物${}^{[16]}$

|目的基因|引物编号|引物序列| |---|---|---| |cyt/b|JLF199|5'-ATACGAGAAAGTAAAATTTGG-3'| |JLR1093|5'-TCATTGAATAGAGTGTGGTT-3'||

 图1 旋毛虫虫种鉴定——核酸检测方法流程图

中国寄生虫学与生寄虫病杂志2025年10月第43卷第5期

Chin J Parasitol Parasit Dis Oct. 2025, Vol.43, No.5

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心江莉主任医师及山东大学周怀瑜教授等，对本文提出了修改意见，在此深表谢意。

伦理批准和患者知情同意本文不涉及伦理批准和患者知情同意。出版授权作者同意以纸质版和网络版的形式同时出版。

数据和材料的可及性本文所参考的参考文献，如有需要，可与作者张玺或王中全联系。

利益冲突作者声明无利益冲突。

作者贡献张玺负责论文设计、资料搜集和论文撰写;崔晶、刘若丹、龙绍蓉、陈木新、陈家旭、付宝权、刘晓雷、刘明远、张雅兰、张红卫责资料搜集和论文修改;王中全负责论文设计指导和论文修改。

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收稿日期:2025-07-07修日期:2025-07-27本文编辑:刘雨舟