专家共识丨实体瘤常见驱动基因DNA和RNA高通量测序共检专家共识（2025版）

一

DNA和RNA高通量测序共检的 临床意义和适合人群 随着精准医学的发展，全面检测肿瘤驱动基因变异已成为肿瘤辅助诊断和靶向/免疫治疗的核心环节。NGS可以一次性提供肿瘤精准诊治所需要的数量众多、类型各异的驱动基因变异，已成为临床的普遍需求。 目前已知的肿瘤驱动基因变异类型包括单核苷酸变异（single nucleotide variation，SNV）、插入缺失（insertion/deletion，Indel）、扩增（amplification，Amp）和融合（fusion）等。SNV/Indel为主要变异形式，针对SNV/Indel的靶向治疗已在临床中广泛应用并发挥重要作用。伴蛋白激酶激活的融合变异虽总体发生率不足3%，但在某些特定癌种或特殊类型的肿瘤中，尤其在驱动基因SNV/Indel变异阴性的患者中，融合基因变异发生率高，如ALK、ROS1、RET基因融合变异在EGFR突变阴性的非小细胞肺癌患者中富集，肝内胆管细胞癌中FGFR2融合发生率高，而在涎腺及乳腺的分泌性癌中常伴随特征性的ETV6：：NTRK3的融合等。携带这些变异的患者接受相应小分子酪氨酸激酶抑制剂（tyrosine kinase inhibitors，TKI）靶向治疗获得的客观缓解率高（57%~94%），生存获益显著。 基于DNA的NGS（DNA-NGS）是目前临床分子检测中最常用的技术，可以高效地检测驱动基因的SNV/Indel，但对融合变异检测存在局限性，其原因有以下几种：长内含子区域（如ROS1、NTRK基因内含子可达数百kb）导致探针覆盖不足；断点区重复序列（如ALK基因的LINE元件）干扰生信分析；部分DNA重排不产生功能性转录本（假阳性率15%~20%）等。相比之下，基于RNA的NGS（RNA-NGS）通过直接分析肿瘤细胞中mRNA序列，避免内含子干扰，可精准识别具有临床意义的融合转录本，大大提高基因融合变异检测的灵敏度，如NTRK、RET、ROS1等基因融合检测下限可低至30个拷贝。研究证实，RNA-NGS可额外检出10.0%~15.3%的基因融合变异，ROS1融合检出率甚至可以提升50%，并减少DNA检测的假阳性结果，提升靶向人群的筛选效率。因此，DNA/RNA-NGS共同检测，通过对DNA和RNA层面的变异进行全面分析，可以实现两者数据的互补，提高变异的检出率和准确性。非小细胞肺癌、肝内胆管癌、甲状腺癌等肿瘤中融合变异发生率高，DNA/RNA-NGS共同检测在这些肿瘤中临床应用价值大。此外，虽然NTRK、RET等基因融合在其他类型实体瘤中发生率低，但对于复发进展的晚期泛实体瘤患者的靶向治疗同样非常重要，对于上述几种情况，采用DNA/RNA-NGS共同检测驱动基因变异可以使更多患者从靶向治疗中获益。 推荐意见1：肿瘤精准诊治所需要检测的驱动基因数量众多，变异类型各异，对于需要同时检测驱动基因突变和基因融合的实体瘤患者，可根据肿瘤类型、临床分期等具体情况，选择DNA/RNA- NGS共检技术，以最大程度提高驱动基因融合变异检测的准确性（2A类）。

二

DNA和RNA高通量测序 共检的常见检测策略 目前临床主要有3种DNA/RNA-NGS共同检测策略，分别是DNA-NGS和RNA-NGS的序贯共检（sequential approach）、平行共检（parallel approach）以及同步共检（unified approach）。序贯共检是指对临床样本先进行DNA-NGS检测，对驱动基因突变阴性的患者使用留存样本或重新采集样本，补充RNA-NGS检测。平行共检是指对同一份样本的DNA和RNA进行抽提，随后分别对DNA和RNA样本进行平行建库、测序和数据分析，即DNA和RNA分管建库后各自测序分析。同步共检是指对同一份样本的DNA和RNA进行抽提，在同一个体系和相同的操作步骤中对核酸进行建库、测序和数据分析，即DNA+RNA同管建库后测序分析。3种DNA/RNA-NGS共同检测策略对比请见图1。 图1  DNA/RNA-NGS共同检测的3种策略对比示意图 序贯共检先通过DNA-NGS方法筛选驱动基因阳性患者，剩余阴性人群再进行RNA-NGS检测，可节省成本，符合卫生经济学原则，是目前临床实践中最常用的检测方式；然而，序贯共检的时间长，对于小活检样本可能出现组织量不足而导致后续无法进行RNA检测的问题。平行共检同样可以提高融合基因的检出率及准确性且不延长报告周期。此外，序贯共检和平行共检在DNA-NGS中若采用杂交捕获法构建文库，可以检测大量基因甚至全基因组的多种变异类型及基因组标签，适用于样本充足的患者，但其操作繁琐、人力成本及经济成本高，尤其是采用杂交法建库时样本消耗多，在样本量少的晚期患者中的临床应用受到限制。同步共检从样本的提取、建库、测序到数据分析全流程在一个体系内完成，检测周期短、样本消耗少，且不增加额外成本，尤其是对于小样本、融合驱动基因变异发生率高、需要快速获得检测结果的肿瘤患者临床价值大。然而，由于在DNA和RNA建库及测序过程中需要避免相互干扰，以及下机后实现DNA和RNA来源数据的精确拆分，同步共检技术难度相对较大，检测的基因数有一定限制，且检测拷贝数变异挑战较大。 推荐意见2：3种DNA/RNA-NGS共检策略各有优缺点，推荐根据肿瘤类型、组织样本量、检测时限，并结合临床需求等其他因素，选择最合适的DNA/RNA-NGS检测策略，从而最大程度满足肿瘤精准诊治的需求（1类）。

三

共检样本选择及核酸质控 1.样本选择：目前，甲醛固定-石蜡包埋（formalin-fixed paraffin-embedded，FFPE）的组织样本是分子病理检测最主要的样本类型。国内外研究证实了FFPE样本提取RNA进行融合基因检测结果与新鲜冷冻样本高度一致。然而，FFPE样本长期存储会引起核酸尤其是RNA的降解，研究发现，约20%保存2年的FFPE样本不满足RNA-NGS检测的要求。因此，在临床应用中，建议尽量选择2年内的FFPE样本进行DNA/RNA- NGS共检，以确保检测的成功率和结果的准确性。穿刺细胞、胸腹腔积液细胞或其沉渣制作的FFPE样本也可应用于DNA/RNA-NGS共检。由于技术局限性等因素，对于液体活检样本目前暂不推荐采用DNA/RNA-NGS共检。 2.FFPE样本采集与制备的关键因素：样本收集时，需系统地记录采集和制备过程。标本采集方法和制备过程（如离体-固定时间间隔、固定方式、固定液浓度、pH值、固定时长和样本厚度等）均会影响后续提取DNA和RNA的质量。建议标本离体后尽快固定，采用3.7%中性缓冲甲醛液进行组织固定，并根据样本情况调节固定时长，通常手术样本为12~48 h，活检样本为6~24 h。应尽量避免因组织脱水、固定不足或过度增加核酸降解的风险。样本制备时，应控制单片组织厚度在5~10 μm，在不影响镜检的前提下尽可能保持较厚。肿瘤占比低于质控标准的样本需要富集肿瘤细胞，切片的保留时间不宜过长，以降低RNA暴露在空气中发生降解的概率，建议在切片后尽快提取核酸进行检测。不同的核酸抽提试剂提取效率可能存在差别，应选择经验证的RNA抽提效果好的试剂盒以及对RNA降解包容度更高的NGS检测方法，以尽可能避免假阴性结果。 3.核酸质控：甲醛的固定和石蜡的高温渗入容易使组织中的核酸发生不同程度的降解和分子间的交联，因此核酸提取后需要进行质量控制。常用的质控指标包括核酸浓度、纯度、总量及完整度。核酸浓度的测定通常使用荧光染料（Qubit）法。Qubit法利用与DNA或RNA特异性结合的染料来检测对应的核酸浓度，能够区分DNA和RNA，准确性和特异性均好于紫外分光光度计法（Nanodrop）。由于后续建库时能够加入的核酸体积通常有限，提取时核酸洗脱体积过大可能导致核酸浓度过低，有可能导致无法与后续建库操作兼容。因此提取时核酸洗脱体积也是需要考虑的重要因素。核酸的纯度一般通过Nanodrop来测定，DNA的纯度要求A260/A280≥1.8（以1.8~2.0为宜），RNA的纯度要求A260/A280≥2.0（以2.0~2.2为宜）。对于A260/A280未达到2.0的RNA样本也可以继续建库测序，根据最终的下机数据量和生信质控情况决定是否可以出具报告。核酸总量等于核酸浓度（Qubit）乘以核酸体积。扩增子建库建议DNA和RNA的核酸总量均≥50 ng；杂交捕获法建议DNA核酸总量≥250 ng，RNA核酸总量≥50 ng，核酸具体用量需参考试剂盒要求。核酸完整度的评估通常使用微流控芯片检测或毛细管电泳技术。相较于DNA，RNA更容易降解。DV200为RNA分子中长度在200 nt以上片段占总RNA的百分比，建库前可考虑通过DV200的值对RNA的完整度进行定量定性的评估。需要注意的是，采用扩增子法建库测序时，由于其扩增产物通常为120~150 bp，因此DV200对扩增子法NGS检测合格率的参考价值有限。 推荐意见3：使用FFPE样本进行DNA/RNA-NGS共检时，宜优先考虑2年内的FFPE样本，暂不推荐将液体活检样本应用于DNA/RNA-NGS共检。进入建库流程前，依据不同的建库测序方法，需要对核酸进行全面的质控，包括浓度、纯度、总量及完整度（1类）。

四

共检文库构建技术方法 在进行肿瘤基因变异检测时，通常需要构建文库对特定的基因区域进行靶向富集。无论是基于DNA还是RNA的NGS，建库过程都需要为核酸加上特定的接头（adaptor）和标签（index），常见的靶向建库方法包括扩增子法和杂交捕获法（表2）。序贯共检和平行共检在DNA和RNA层面可采用两种建库法的不同组合形式分别建库，对于同步共检测法一般采用DNA/RNA同步扩增子法建库。 1.扩增子法建库：扩增子法建库是一种基于引物池实现特定基因区域扩增、得到文库的方法。由于在建库初期就锁定目标区域，扩增子法能高效富集目标片段，上靶率高，且非目标片段少。该方法能将有限的起始核酸量放大至足够检测的核酸量，适用于起始核酸量较小的情况，如肿瘤细胞稀少或RNA质量欠佳的FFPE样本。研究表明，扩增子法建库最低仅需10 ng DNA和10 ng RNA。扩增子建库的另外一个优点是步骤简单、周期较短。RNA反转录为cDNA后，扩增子文库构建过程接近于PCR反应，可短至4~5 h，有利于提高分子检测报告的时效性。引物设计是扩增子法应用的技术挑战。多重PCR中引物二聚体、引物间非特异性扩增（脱靶）和引物扩增效率的均一性是首要关注的问题，近年引入高性能计算机参与设计后，引物池数量得到大幅提升，引物之间的兼容程度也得以优化。双端引物多重扩增子（traditional opposing primers）法是目前常用的扩增子建库法，其在伴侣基因上同时设计引物，可检测到已知覆盖范围的融合基因变异，但难于检测未知或者罕见的伴侣基因的融合形式。单端锚定多重扩增PCR（anchored multiplex PCR）是应用相对较少的另一种扩增子建库法，其仅需在驱动基因上设计固定引物，利用自由端通用引物（universal primers）扩增到所有可能的伴侣基因和融合形式，并可以报告融合伴侣基因和断点位置。目前，受限于扩增子技术方法的局限性，基于该方法的NGS检测基因覆盖相对较少，通常覆盖数十个基因，一般不超过200个基因，另外，对于大片段缺失的检测性能也欠佳。 2.杂交捕获法建库：杂交捕获法对目标区域的靶向富集是通过探针设计覆盖实现的，按照相应的参考基因组序列，采用定长的探针以一定的相互关系（如首尾相连式或叠瓦式）展开铺设，覆盖目标基因特定区域。该方法除考虑基因组同源性对上靶率的影响外，探针与探针之间几乎不会发生干扰，均一性好，相比扩增子法测序，其探针设计更加简便。然而，杂交捕获法操作复杂且多步骤间转化率差异较大，在文库构建过程中，目标片段难以在每一步充分保留，因而文库构建需要提供更多的起始样本投入量。捕获法建库中，DNA和RNA通常分别需要50~200 ng和50~1 000 ng，核酸投入量具体需参考检测试剂盒的要求。 3.DNA/RNA同步建库：序贯共检和平行共检，DNA和RNA的文库构建方法可分别或同时采用扩增子法和杂交捕获法，但由于DNA和RNA的文库构建分别在独立的体系中完成，互不干扰，技术难度相对较低。而同步共检是在同一个体系下对DNA和RNA同管建库，无论是扩增子法还是杂交捕获法建库，技术上均有一定挑战。同步共检建库之前首先需要将RNA逆转录生成cDNA，再和基因组DNA模板共同用于后续的反应。同步共检建库关键挑战在于如何在同一个反应体系里面通过引物或探针分别获取DNA和cDNA模板序列。扩增子法可通过跨内含子-外显子边界引物设计实现核酸来源区分，即针对点突变/插入缺失突变分别在外显子和内含子区域设计引物，针对融合变异在两个外显子设计引物，从而在一个反应中同步完成RNA融合和DNA点突变/插入缺失的检测分析，实现DNA/RNA-NGS同步共检。杂交捕获法由于DNA和cDNA一起杂交，捕获过程存在潜在的相互影响，cDNA来源的reads被DNA靶区间的探针大量捕获，占用过多的数据量，可能导致DNA序列变异被漏检，且无法区分DNA和RNA来源的序列数据，对质控和数据分析造成较大挑战。由于以上多方面原因，目前国内外尚未见到基于捕获法的同步共检产品，扩增子法是同步共检技术的主要方法。 推荐意见4：扩增子法和杂交捕获法均可应用于平行共检和序贯共检文库构建。扩增子法则是目前同步共检的主要文库构建方法（2A类）。

五

共检的生物信息学质控 传统DNA-NGS的通用生物信息学分析流程大多适用于DNA/RNA-NGS共检的数据分析，包括数据清洗（如去除接头序列、低质量序列等）、参照基因组序列比对、去重、插入或缺失重比对、碱基与质量校正、变异识别、注释、过滤后输出等步骤。平行共检和序贯共检DNA和RNA的建库和测序独立进行，生信分析难度低。同步共检的数据分析，需特殊关注DNA与RNA来源的序列拆分，以用于各自相应的变异类型检测及质控。质量控制参数包括下机数据质控（如数据量、Q30等）、数据拆分清洗质控、数据比对及比对后处理质控、变异过滤和对照样本质控等多个方面，应根据检测产品和试剂盒说明书予以相应关注。DNA/RNA-NGS共检重要的生信指标意义和参考标准见表3。 \n \n 表3 DNA/RNA-NGS共检质控参数及参考标准\n \n \n 质控参数\n 数据来源\n 意义\n 参考标准\n \n \n Clean Reads Q30\n DNA+RNA\n 符合,Q30不符合要求说明该批次测序质量不佳,可能影响整个批次数据的分析结果\n >80%\n \n \n 平均有效测序深度(去重后平均测序深度)\n DNA\n DNA数据中所有碱基数除以检测区域的总长;平均有效测序深度不符合预期时,DNA样本整体有效测序深度不足,导致检测结果可能无法达到产品声称的检测性能\n =性能验证的最低要求\n \n \n 覆盖均一性\n DNA\n 均一性描述了DNA目标区域的数据分布情况。区域覆盖均一性可反映文库制备扩增是否符合产品预期范围\n 宜>90%,或符合性能验证的分析要求\n \n \n 核心位点合格比例\n DNA\n 实际测序深度超过质控要求最低测序深度的核心靶向用药位点比例;如果待测样本核心位点的深度不足,存在核心用药位点变异检测性能受损,存在漏检的可能性\n ≥性能验证的最低阈值要求\n \n \n 内参基因转录本表达\n RNA\n RNA数据中内控基因转录序列数,代表RNA来源的内控基因表达;该指标未通过质控提示基于RNA水平的变异检测性能下降,存在漏检的可能性\n ≥性能验证的最低要求\n \n\n\n DNA/RNA-NGS共检存在4种生信质控结果：DNA和RNA均合格；DNA合格、RNA不合格；DNA不合格、RNA合格；DNA和RNA均不合格。共检的2种核酸质控均合格时，应正常出具报告。当某一种核酸质控失败，另一种核酸质控合格且检测到明确的驱动基因变异时，建议对质控合格的核酸检测结果继续出具临床报告，以保障检测的临床价值最大化。如DNA质控未通过但RNA质控通过且检测到基因融合阳性，或RNA质控未通过但DNA质控通过且检测到SNV或Indel变异，则可出具分子检测报告。如果其中一项未通过且检测结果为阴性，则建议重新采集样本进行检测。 另外，无论是DNA还是RNA，如在质控未通过情况下检测到驱动基因变异，经生信分析排除假阳性后，仍建议采用其他方法进行验证，如qPCR、FISH等方法。如变异真实可靠，建议在临床报告中报出，同时说明质控未达标的风险。若DNA和RNA质控均未通过且检测结果为阴性，建议重新采样进行检测。 推荐意见5：DNA和RNA高通量测序共检的生物信息学分析，需要对DNA和RNA来源数据分别进行数据质控，确认符合预期。对于两种核酸测序均未通过质控或者其中一种未通过质控，仍检测到可靶向用药的变异者，经过生信分析以及其他方法验证证实该变异可信，可出具临床报告并注明质控风险，或根据具体情况重新检测（2A类）。

六

DNA和RNA高通量测序共检报告规范 NGS的分子诊断报告应包括但不限于以下内容：（1）基本信息：患者信息（如姓名、性别、年龄、住院号/门诊号等）、样本信息（如送检样本部位、送检时间、病理号/样本编号、检测样本类型等）、临床/病理诊断等；（2）检测项目信息：检测项目名称、所用检测平台和技术方法、检测范围（明确检测的分子标志物及其位点信息）；（3）检测结果：基因名称、cDNA的经典转录本编号、符合人类基因组变异协会（Human Genome Variation Society，HGVS）书写规范的变异类型、丰度/拷贝数、变异解读；（4）临床解读：体细胞NGS报告中的临床意义解读；（5）质控结果（病理质控、核酸质控、文库及测序质控）；（6）检测局限性；（7）风险报告需额外注明。 推荐意见6：规范的DNA/RNA-NGS共检报告应包括患者的基本信息、样本的基本信息、质控信息、检测结果、变异解读等内容，还需要对检测的局限性及风险报告作必要的说明（1类）。 需要注意的是，分子病理实验室进行DNA/RNA-NGS共检，从样本接收到报告签发，需经过检测前、检测中、检测后全流程的质控，以保证检测的规范性和准确性，推荐的DNA/RNA-NGS共同检测流程如图2。 图2  DNA/RNA-NGS共检流程图［①病理质控：标本来源/类型、病变部位、病理类型、肿瘤占比或细胞量等；②核酸质控：核酸浓度、纯度、总量及完整度等；③文库质控：文库的浓度、片段大小等；④测序数据生信质控：均一性、Q30、有效测序深度、内参基因转录本表达（RNA）等］ 本文结合专家观点及相关研究结果，主要对DNA/RNA-NGS共检策略在实体瘤常见驱动基因检测在临床诊疗实践中的应用共识进行了阐述。目前尚缺乏基于DNA/RNA-NGS共检指导肿瘤靶向治疗的大样本前瞻性临床队列研究，建议有条件医疗中心开展相关研究，进一步为该技术临床应用提供更高等级的循证医学依据。随着技术和流程的不断优化，DNA/RNA-NGS共检策略将更加普及，有助于发现更多驱动基因突变/融合，提供更精确和全面的分子诊断信息，以优化个性化治疗方案。 共识局限性和免责声明 本文中公布的共识内容由专家组成员依据现有医学证据及临床实践经验共同讨论形成。其中内容可能不够全面或不够充分。医学知识发展迅速，在本共识产生到发表期间均可能出现新的证据，而这些可能并没有体现在本共识中。另外，因检测流程复杂，实验室条件差异以及患者之间存在个体化差异等影响检测决策或结果。因此，本共识中内容的采用应结合检测条件、政策许可以及专业人员的专业知识独立判断。对本共识的使用是自愿的。专家组成员明确否认对文中所提及的任何产品具有商业性目的。专家组对因使用本共识内容而造成的或与之相关的任何人身伤害或财产损失，或任何错误或遗漏不承担责任 参与本共识讨论和修改的专家组成员（按单位名称汉语拼音字母顺序排列）：北京大学人民医院（韩博）；北京大学医学部（张波）；北京大学肿瘤医院（林冬梅）；福建省肿瘤医院（陈刚、师怡）；复旦大学附属肿瘤医院（周晓燕、李媛、柏乾明）；复旦大学附属中山医院（纪元）；哈尔滨医科大学附属肿瘤医院（孟宏学）；河北医科大学第四医院（刘月平）；河南省肿瘤医院（马杰）；湖北省肿瘤医院（岳君秋）；暨南大学附属第一医院（陆元志）；空军军医大学西京医院（王哲、胡沛臻）；陆军军医大学大坪医院（王秋实）；南京医科大学第一附属医院/江苏省人民医院（张智弘）；南方医科大学南方医院（梁莉）；青岛大学附属医院（邢晓明）；上海交通大学医学院附属仁济医院（刘泽兵）；上海市肺科医院（武春燕）；上海交通大学医学院附属胸科医院（韩昱晨）；上海交通大学医学院附属瑞金医院（董磊）；首都医科大学宣武医院（滕梁红）；思路迪科技（上海）有限公司（熊磊、黄萌理）；四川大学华西医院（唐源）；四川省肿瘤医院（刘洋）；苏州大学附属第一医院（郭凌川）；天津市肿瘤医院（张鲁）；无锡臻和生物科技有限公司（陈豫）；厦门艾德生物医药科技股份有限公司（朱长斌、李旭超）；云南省肿瘤医院（周永春）；浙江大学附属邵逸夫医院（胡晓彤）；浙江省肿瘤医院（苏丹、尹文娟、来茜）；郑州大学第一附属医院（姜国忠）；中国医学科学院 北京协和医学院 北京协和医院（梁智勇、吴焕文、武莎斐）；中国医学科学院肿瘤医院（应建明）；中国科学技术大学附属第一医院（叶庆）；中山大学第一附属医院（柯尊富）；中山大学肿瘤防治中心（王芳）；中山大学孙逸仙纪念医院（欧阳能太） 点击左下角“阅读原文”，获取更多文章信息 来源：中华病理学杂志 编辑：于雅丽 初审：沈锡宾 终审：刘冰

推荐意见与 GRADE 证据分级