标准与规范 | 细菌细胞外囊泡命名与分离检测中国专家共识

二、储存

当样本运输到实验室后，最好立即进行BEVs分离，否则建议在必要的前处理后分装样本，于-80 ℃冻存数周或数月。另外，也应该评估不同样本储存温度及冻融循环的次数对分离得到的BEVs的物理、化学特性的影响。而对于已经从样本中分离BEVs，建议以PBS作为缓冲介质，在-80 ℃下储存。现今，冷冻干燥、喷雾干燥和深低温储存等新兴技术可能成为有效的替代方案，它们可以最大程度保持BEVs的结构完整性、稳定性和免疫原性［28，102］。此外，评估缓冲溶液、保存容器和冻融循环次数对BEVs的影响，也可以为后续研究提供重要参考。

推荐意见8：未能及时处理的样本应进行必要的前处理后分装保存于-80 ℃；已分离得到的BEVs应在-80 ℃保存。避免反复冻融。（证据质量：高；推荐等级：强推荐）

BEVs的检测

一、BEVs的浓度、大小及形态表征

（一）浓度和大小

BEVs根据其来源和内容物的不同，尺寸大小也不同，但较为集中在20~400 nm的直径范围［4］。目前针对BEVs的浓度和大小的表征方法常用的是：纳米颗粒跟踪分析技术、动态光散射技术、可调电阻式脉冲传感技术、纳米流式细胞术。

1. 纳米颗粒跟踪分析技术（nanoparticle tracking analysis，NTA）：最常用和成熟的方法，已被广泛用于表征BEVs的尺寸和分布。它采用激光散射显微成像技术，记录纳米粒子在溶液中的布朗运动轨迹，通过Stokes-Einstein方程推算粒子大小，可以快速准确地分析较低浓度水平的粒子，并结合图像得出直观的结论。但NTA本身对于检测时的温度、浓度和校准都有着较高要求，且特异性较差，无法分辨溶液中的BEVs、细胞碎片和可能的污染物，也不能区别不同源性的BEVs［4，103-106］。

2. 动态光散射技术（dynamic light scattering，DLS）：利用光射到远小于其波长的小颗粒上时会产生瑞利散射现象，通过观察散射光的强度随时间的变化推算出溶液中颗粒的大小，该技术易于操作、样品制备简单，且检测敏感度高，可以快速测量下限为1 nm的颗粒；但DLS易受到颗粒的颜色、电性、磁性等理化特性的影响，并对灰尘和杂质十分敏感，因此它只适合相对较高浓度且大小均一的纳米颗粒的尺寸测量，且无法测量样品中的颗粒浓度，特异性较低［103-104，106］。

3. 其他方法：可调电阻式脉冲传感（tunable resistive pulse sensing，TRPS）可以替代NTA，用于测量BEVs的浓度和尺寸分布，采样频率更高、灵敏度好，但TRPS纳米结构复杂，采样效率、准确性、特异性较低［103］。纳米流式细胞术（nano-flow cytometry，FCM）可以利用BEVs表面特异性标志物对应的抗体对BEVs进行定量分析和分类，具有速度快、精度高、通量高、要求样品浓度低、重复性好、定量测量能力好的特点，但是对于直径小、折射率低的囊泡，其准确性和分辨率较差［104，106］。除此之外，还可以通过拉曼散射、电泳迁移率、荧光迁移率、膜刚度和折射率等方法来表征BEVs。上述测定BEVs浓度和大小的方法都各有优缺点，因此，在BEVs的研究中，往往需要结合不同的方法共同表征。

（二）形态

传统的光学显微镜很难分辨出尺寸小于200 nm的结构，因此推荐使用各种电子显微镜及原子力显微镜来观察BEVs的形态和结构。

1. 透射电子显微镜（transmission electron microscope，TEM）：是最常用的可视化BEVs的方法，可以观察到BEVs的内部结构和形态，也可以与免疫胶体金技术相结合，以获得进一步的分子生物学特性。通过TEM捕获的BEVs的图像可以看到BEVs是具有清晰双层膜结构的球型囊泡，显示出囊泡的经典的杯状、茶托状形态，为BEVs的形态学特征提供了明确的证据。但TEM样品制备复杂，视野有限，检测通量低，样品制备中使用的一些化学染色或涂层可能会破坏BEVs结构［106-107］。

2. 其他方法：冷冻透射电子显微镜具有分辨率高、检测速度快的优点。冷冻的样品，通过低温透射电镜成像，不需要添加任何重金属或固定剂，对BEVs的形态结构的影响较少，相比TEM能更好地展示原本结构。但它具有信噪比低、成本高、通量低的缺点［106，108］。扫描电子显微镜样品制备简单，图像放大范围广，分辨率高，三维感觉丰富，可进行微组分分析，但是扫描电镜的分辨率可能低于透射电镜，对于多来源的BEVs群体无法进行分析，对多分散样品的成像条件恶劣，通量低，且不能反映活细胞中囊泡的形态和生物成分［106，109］。原子力显微镜样品不需要特殊处理，无损伤，空间分辨率高，具有广泛的适用性，可用于表征单个BEVs的动力学及其表面拓扑信息和微环境的特性（例如刚度，附着力），但它也存在成像范围小、探针影响大、样品质量要求高、检测过程复杂、检测速度慢等缺点［29，106，109］。因此，实际应用中需要结合根据待测样本的浓度、纯度、预期价格、检测时间等方面进行选择。BEVs与EEVs在浓度大小方面趋向一致，形状也多为经典的茶托状囊泡结构，这是两者的共同点。不同点在于BEVs携载的外膜蛋白和内容物（核酸、质粒及蛋白）与EEVs有极大的区别。在形态方面，通过高分辨率的电子显微镜观察囊泡内部的亚结构可作为区别两者的方法之一。

推荐意见9：通过浓度大小和形态对BEVs进行表征，是进行BEVs质量控制重要且必须的步骤，保障后续研究的关键，建议采用NTA技术对BEVs浓度和大小进行表征，采用TEM对BEVs形态进行鉴定。（证据质量：高；推荐等级：强推荐）

二、BEVs生物标志物检测

有研究表明BEVs的脂质组成可能因细菌种类而异。革兰阴性菌分泌的OMVs富含脂多糖（lipopolysaccharide，LPS），有研究通过鲎试剂、Toll样受体4报道基因分析和免疫电镜结果，定量测定了LPS阳性的BEVs［78］。在牙龈卟啉单胞菌中，OMVs携带有长糖链和脱酰基脂质A的LPS分子；而在沙门氏菌中，脱酰基脂质A在OMVs中积累。此外，在E. coli中，OMVs包括参与膜折叠的脂质，如甘油磷脂、磷脂酰甘油、磷脂酰乙醇胺和心磷脂［110］；国内有研究使用Stewart磷脂分析方法来定量肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，K. pneumoniae）OMVs的含量［111］。在炭疽杆菌和肺炎链球菌中，CMVs富含C12~C16链饱和脂肪酸；L. Monocytogenes的CMVs中富含磷脂酰乙醇胺、鞘脂和三酰基甘油［110］。有研究在一个基于纳米FCM的BEVs检测平台分别采用LPS和脂磷壁酸（lipoteichoic acids，LTA）对革兰阴性和革兰阳性菌BEVs进行验证，发现LPS和LTA具有良好的作为BEVs标志物的应用潜力［112］。值得注意的是，近期研究表明，EEVs可以通过脂质双分子层与LPS的脂质A之间的相互作用来捕获LPS，因此在鉴定时需对除BEVs之外的LPS阳性的其他亚群进行区分［113-115］。此外，还可以通过外膜蛋白、周质蛋白及其他的特定蛋白来对BEVs进行鉴定。革兰阴性菌释放的OMVs富含外膜蛋白（outer membrane protein，Omp），如OmpA、OmpC和OmpF，以及周质蛋白和碱性磷酸酶。Prosseda等人使用外膜蛋白OmpF和OmpC来相对量化E. coli的OMV［116］。鲍曼不动杆菌产生的OMVs中包含OmpA蛋白［117］。L. Monocytogenes的CMVs中含有母体细菌溶血素等特定蛋白［118］。变形链球菌释放的CMVs包含环境脱氧核糖核酸（deoxyribonucleic acid，DNA）和黏附蛋白［119］。结核分枝杆菌分泌的CMVs含有分枝杆菌素［120］。不同来源的BEVs也常包含病原微生物的特定基因，如来自铜绿假单胞菌的BEVs中，大多数DNA携带与抗生素抗药性、毒力和应激反应有关的特定功能的基因；而在革兰阳性产气荚膜梭菌中，BEVs携带编码细菌毒素的基因，如：α-毒素基因和产气荚膜溶素O［110］。

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2. Vesiclepedia数据库：Vesiclepedia数据库是EVs相关脂质、RNA和蛋白质的手动检索数据库（http：//www.microvesicles.org），包括实验编号、鉴定分子、EVs类型、分离方法等［142］。在一项寻找非酒精性脂肪肝生物标志物的研究中，研究人员利用该数据库来鉴定来自EVs的每种蛋白质，结合蛋白质图谱，最终确定其重点是膜蛋白，开发了一个潜在的EVs膜蛋白生物标志物的综合列表［143］。

3. EVpedia数据库：EVpedia数据库是韩国项浦大学创建的一个较为全面展示EVs蛋白质组学、转录组学的高通量数据集（http：//evpedia.info），可提供相关的出版物及生物信息学分析工具［144］。

推荐意见15：多个数据库联用分析BEVs相关生物信息。（证据质量：高；推荐等级：强推荐）

总结与展望

BEVs是由细菌释放到外界的特定类型的脂质囊泡，这些囊泡的直径约为40~200 nm，包含各种内容物，如蛋白质、核酸及脂质等多种细菌成分。BEVs参与疾病发生发展过程，如癌症、细菌感染和多种病毒感染等［145-148］，揭示BEVs与人体疾病之间的关联，将为解决临床多种疾病的治疗打开一系列令人振奋的新大门，即实现“细菌-人体”跨物种的创新诊疗手段。

然而，BEVs要真正应用于临床诊疗层面，有两大挑战亟待科研人员攻克。第一：高效率、高产量的BEVs分离提取方法的建立。根据ISEV全球调查，UC是最常用的BEVs分离和富集技术［37，149］。但是UC的BEVs得率偏低，难以满足后续临床治疗的巨大需求，而且还可能面临其他成分，尤其是EEVs等的污染或高离心力对BEVs结构的破坏等问题。因此，本共识倡议建立公认的BEVs分离方法，为其未来的临床应用奠定技术基础。第二：高精度BEVs检测平台的搭建。除了解决不同类型BEVs的分离策略，还应为BEVs的检测、后续研究以及临床应用提供解决方案。大数据分析的日益成熟及其独特优势使其成为研究各种生物学问题的有利工具。细菌BEVs携带多种生物活性物质，增加了BEVs异质性分析和功能挖掘的难度。因此，BEVs 识别和分析的关键步骤是瞄准携带的特征物质，针对这些特征物质进行分析。目前，研究者可以采用针对菌群分析的宏基因组学对BEVs的组成成分进行系统性探究，来更好地理解其在微生物生态系统中的角色和功能。

此外，工作组号召建立整合式BEVs数据库，包括BEVs生物标志物库，收录不同类型 BEVs 的蛋白质和特定分子信息，以便早日实现对 BEVs单颗粒的定量分析；BEVs临床治疗数据库，纳入治疗用BEVs的适应证、给药途径、保存方法、生物相容性和安全性等；工程化 BEVs数据库，详细记录具体制备方法，如模式菌的选择、工程转化/药物加载方法［150］等。

目前，与 BEVs相关的研究正在迅速发展，有望阐明维持人类健康所必需的微生物与宿主之间复杂的交流网络，为推动基于 BEVs 的新治疗策略奠定坚实的基础。BEVs研究之路尽管面临着诸多挑战，但仍值得研究者去探索，并推动诊断和治疗方式的新变革。

共识制订专家组成员

组长：郑磊（南方医科大学南方医院检验医学科）；王前（南方医科大学珠江医院检验医学部）

副组长：李敏（上海交通大学医学院附属仁济医院检验科）；陈烨（南方医科大学深圳医院消化内科）；聂广军（国家纳米科学中心）；吴稚伟（南京大学医学院）；熊思东（苏州大学生物医学研究院）；周宏伟（南方医科大学珠江医院检验医学部）；杨子峰（广州医科大学附属第一医院广州呼吸健康研究院）

执笔者：胡秀梅（南方医科大学南方医院检验医学科）；司徒博（南方医科大学南方医院检验医学科）；王静宇（南方医科大学南方医院检验医学科）；黄媚（南方医科大学珠江医院检验医学部）；薛艺聪（南方医科大学南方医院检验医学科）

委员（按姓氏汉语拼音排序）：陈烨（南方医科大学深圳医院消化内科）；陈珣珣（广东省结核病控制中心结核病研究所）；常文娇（中国科学技术大学附属第一医院检验科）；戴媛媛（中国科学技术大学附属第一医院检验科）；杜玉琪（南方医科大学南方医院检验医学科）；傅煜轩（苏州大学生物医学研究院）；关文达（广州医科大学附属第一医院广州呼吸健康研究院）；胡秀梅（南方医科大学南方医院检验医学科）；黄媚（南方医科大学珠江医院检验医学科）；黄馨玥（南方医科大学珠江医院检验医学部）；井莹莹（上海大学转化医学研究院）；江菱蕾（中生复诺健生物科技上海有限公司）；李敏（上海交通大学医学院附属仁济医院检验科）；龙钢（复旦大学基础医学院）；刘晗（上海大学转化医学研究院）；马筱玲（中国科技大学附属第一医院检验科）；聂广军（国家纳米科学中心）；欧子豪（南方医科大学南方医院检验医学科）；平渊（浙江大学药学院）；潘若儒（南方医科大学南方医院检验医学科）；苏佳灿（上海大学转化医学研究院）；司徒博（南方医科大学南方医院检验医学科）；沈晨光（南方医科大学公共卫生学院）；孙希（中山大学医学院）；王前（南方医科大学珠江医院检验医学部）；王璋（华南师范大学生命科学学院）；王涓（华南农业大学食品学院）；王静宇（南方医科大学南方医院检验医学科）；温振科（苏州大学生物医学研究院）；吴稚伟（南京大学医学院）；熊思东（苏州大学生物医学研究院）；夏云（重庆医科大学附属第一医院检验科）；谢辉（中南大学湘雅医院运动系统研究中心）；薛艺聪（南方医科大学南方医院检验医学科）；杨子峰（广州医科大学附属第一医院广州呼吸健康研究院）；叶建中（温州医科大学附属第一医院检验科）；郑磊（南方医科大学南方医院检验医学科）；周宏伟（南方医科大学珠江医院检验医学部）；周铁丽（温州医科大学附属第一医院检验科）；甄浩君（南方医科大学南方医院检验医学科）

利益冲突

所有作者声明不存在利益冲突

参考文献（下滑查看）：

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推荐意见11：对于有已知序列的核酸检测，推荐使用PCR；对于未知的核酸检测，可使用二代测序、基因芯片技术，该方法可以用于分析和验证BEVs中核酸含量。（证据质量：高；推荐等级：强推荐）

二、BEV脂质组学分析

根据以往的报道，BEVs的脂质组成丰富多样，不同的脂质在生命活动中发挥着不同的作用。近年来，BEVs脂质成分分析的主要方法仍然是质谱法，其中包括串联质谱分析技术（tandem mass spectrometry，MS/MS）。但在提取脂质的过程中会存在降解、破坏等情况，因此在提取BEVs的脂质时需要遵循标准程序。由于脂质分子具有高度的多样性，容易产生质谱离子的重叠，所以为了提高脂类的分辨效率，推荐采用高分辨液相色谱-串联质谱（liquid chromatograph-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）法。而在使用LC-MS/MS法时，需要特别注意的是要用已知的标准对样品内部进行重新校准［129］。

由于研究目的不同，脂质组学分析又可以分为靶向脂质组学分析以及非靶向脂质组学分析。靶向脂质组学分析要求提前设置好所需分析的特定目标，并建议使用灵敏度高的质谱仪进行分析。而非靶向脂质组学则是通过分析样品中全部脂质，经数据分析发现其中的规律及所涉及到的脂质类别或分子，从而达到相关研究目的。

标题: 标准与规范 | 细菌细胞外囊泡命名与分离检测中国专家共识

作者: 中华医学杂志

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引用本文：中国研究型医院学会细胞外囊泡研究与应用专业委员会微生物细胞外囊泡专家工作组, 广东省精准医学应用学会细胞外囊泡分会. 细菌细胞外囊泡命名与分离检测中国专家共识 [J] . 中华医学杂志, 2024, 104(31) : 2910-2927. DOI: 10.3760/cma.j.cn112137-20240104-00030.

通信作者：郑磊，南方医科大学南方医院检验医学科，广州 510515，Email：nfyyzhenglei@smu.edu.cn；王前，南方医科大学珠江医院检验医学部，广州 510260，Email：wangqian@smu.edu.cn.

摘要

细菌细胞外囊泡（BEVs）可介导细菌与细菌、细菌与宿主间的相互作用，在疾病发生发展中发挥着重要作用。然而，目前针对BEVs的命名与分离检测尚无统一标准，导致相关研究结果不一致，进而阻碍了对BEVs更真实、更客观地系统性分析。因此，亟须建立基于BEVs命名、分离与检测基本研究方法的标准和共识，以推动BEVs的临床转化与应用。本共识由汇集了经验丰富的医学检验领域专家、微生物学专家和材料生物学专家组成的工作组撰写，介绍了常用的BEVs分离检测技术与基本方法，提供了改善BEVs研究可操作性和可重复性的建议和注意事项，并强调了BEVs走向临床应用面临的关键问题和挑战，以期为后续研究提供参考。

细菌细胞外囊泡（bacterial extracellular vesicles，BEVs）是由革兰阴性菌或革兰阳性菌产生的纳米级膜性颗粒，携带多种菌源性物质，如脂质、蛋白质、核酸等［1, 2］。前期基础研究发现，BEVs担负着“信使”角色，不仅参与细菌间的通讯交流，也在细菌和宿主细胞之间发挥着跨界调控作用。随着研究的不断深入，BEVs的临床应用潜力被不断挖掘并吸引了众多研究者的兴趣。BEVs因携带多种生物活性分子，在疾病诊断中具有重要意义。因此，精准分析BEVs活性成分及动态变化，有助于获得对疾病状态的重要理解，为疾病早期诊断与预后监测提供新的解决方案。

与无活性的人工合成纳米材料相比，BEVs具有良好的稳定性与生物相容性，可更精准地与特定组织或细胞相互作用，有望成为新兴的药物递送载体。此外，BEVs具有天然的免疫原性，其携带的菌源性物质能够有效调节免疫系统活性，可以作为疫苗载体或免疫调节剂，这进一步彰显了BEVs在疾病预防中的应用潜力。然而，当前BEVs研究仍面临重重困难。BEVs来源多样，组成复杂，目前缺乏有效的分离和表征方法，严重限制了BEVs实际临床诊疗中的应用。基于上述背景，由汇集了经验丰富的医学检验领域专家、微生物学专家和材料生物学专家组成的工作组提出了BEVs命名与分离检测基本研究方法的优化建议，并形成了本专家共识。希望本共识的发表能够为深入挖掘BEVs在各种临床场景中的应用潜力提供支持，促进高质量研究持续开展。

共识制订流程和方法

一、共识发起机构与专家组成员

本共识由中国细胞外囊泡学会（CSEV）微生物囊泡专家组（以下简称专家组）牵头制订。2023年7月26日启动，成员间多次线上线下反复讨论形成初稿，之后召开3次专家组研讨会，最终针对推荐意见进行投票表决，于2023年12月25日完成定稿。本共识专家组成员均填写了利益声明表，不存在与本共识直接相关的利益冲突。

二、共识注册与计划书撰写

本共识已经在国际实践指南注册与透明化平台（International Practice Guidelines Registry Platform，IPGRP.http：//www.guidelines-registry.cn/）进行注册，注册号为PREPARE-2024CN794。读者如需获取本共识的详细计划书，可联系IPGRP注册平台索要。

三、本共识的适用人群

本共识适用于不同院校、科研机构、生物技术公司及不同等级医院从事BEVs研究的人员，包括但不限于BEVs研究者、微生物学家、实验技术员和临床医/技师等，涵盖常用的BEVs分离检测技术与基本方法，旨在为BEVs基础研究提供参考，需根据实验需求、研究平台、经费等具体情况酌情参考应用。

四、基本框架构思与确定

专家组通过问卷调研的形式，初步拟定了BEVs基础研究中面临的核心问题，经反复讨论修改，最终围绕五大问题（术语命名、样本收集和前处理、BEVs的分离与表征及BEVs的下游分析）展开，并形成了15条推荐意见。

五、证据的检索

专家组针对最终纳入的五大核心问题，按照BEVs研究中涉及的不同样本类型、技术原理和分析手段对其进行解构，并通过检索 PubMed、Web of Science、万方和中国知网数据库，综合国内外研究进展选择循证医学证据，最终将150篇文献或指南纳入引文。

六、证据的评价与分级

专家组根据选定的文献证据，对每个核心问题及凝练的相应推荐意见的必要性和重要性进行二轮审稿讨论，对于证据不充分或相互矛盾的建议进行补充和完善。根据评估、制订及评价分级（grades of recommendation，assessment，development and evaluation，GRADE）办法，专家组对更新的共识条目进行多轮投票表决（强或弱、赞成或反对），最终制定完善的推荐意见分级（表1）［3］。

术语命名

一、BEVs的分类

目前尚未针对BEVs制定统一的命名规则，其主要以来源的母细菌的革兰染色属性进行归类。（1）来自革兰阴性菌的BEVs被称为外膜囊泡（outer membrane vesicles，OMVs）；（2）来自革兰阳性菌的BEVs被称为细胞质膜囊泡（cytoplasmic membrane vesicles，CMVs）。随着高分辨率流式细胞仪、透射电子显微镜和冷冻电子显微镜等技术的不断革新，人们对革兰阴性菌和革兰阳性菌释放BEVs的方式有了更深入的认识，由此将革兰阴性菌BEVs划分为OMVs、外内膜囊泡（outer-inner membrane vesicles，OIMVs）、爆炸式外膜囊泡（explosive outer membrane vesicles，EOMVs）和爆炸式外-内膜囊泡（explosive outer-inner membrane vesicles，EOIMVs）四大类，而革兰阳性菌BEVs根据是否经内溶素（endolysin）作用分为裂解产生的爆炸式细胞质膜囊泡（explosive cytoplasmic membrane vesicles，ECMVs）和起泡机制产生的CMVs［4, 5］。

二、天然BEVs的命名规则

为了推动BEVs检测、鉴定与分析的基础研究，并进一步拓展其在疾病诊断和治疗中的应用，更准确的BEVs命名规则亟需形成。在此，工作组建议天然BEVs的命名应至少涵盖细菌菌种来源，同时可以缩写属名以保证名称的简洁性，如大肠埃希菌（Escherichia coli，E. coli）来源的BEVs表示为E. coli OMVs［6］，单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes，L. Monocytogenes）来源的BEVs表示为L. Monocytogenes CMVs［7］，研究使用的不同菌株类型时应单独注明。

推荐意见1：天然BEVs的命名应至少涵盖细菌菌种来源，同时可以缩写属名以保证名称的简洁性。（证据质量：中；推荐等级：弱推荐）

三、工程化BEVs的命名规则

近年来工程化BEVs在基础研究、生物技术等领域发挥了重要作用，尤其在药物递送、疫苗开发等方面具有良好的临床应用潜能，激起研究者的广泛关注。工程化BEVs通常经过改良，加入特定分子（异源抗原或疫苗、抗感染药物及抗肿瘤药物等）以达到或增强其预期效果。相关研究中针对工程化BEVs的命名主要以工程化物质与BEVs类型作为切入点，例如，工程化构建的负载程序性死亡受体1的革兰阴性菌来源的外膜囊泡可以表示为OMVs-PD1［8］，携载微小核糖核酸（micro ribonucleic acid，mRNA）疫苗且被修饰有RNA 结合蛋白 L7Ae 和溶酶体逃逸蛋白李斯特菌溶血素O的革兰阴性菌来源的外膜囊泡可以表示为OMV-LL-mRNA［9］。为了更准确地定义工程化BEVs，工作组建议BEVs的命名应反映如下两个要点：（1）母细菌来源；（2）工程化物质。例如，E.coli来源的OMVs负载阿霉素可以表示为E.coli OMVs-DOX，使用的菌株类型应在研究中明确说明。

推荐意见2：工程化BEVs的命名应主要反映母细菌来源与工程化物质，命名原则需在研究中明确定义。（证据质量：中；推荐等级：弱推荐）

样本收集和前处理

一、细菌培养液

不同细菌的培养条件各异，应根据其本身的特性，选择适宜细菌生长的培养基，并在适宜的生长温度下将细菌培养至对数生长期，在此基础上采用差速离心步骤进行前处理，获得用于后续BEVs分离的菌液上清。在细菌培养液收集和前处理的整个过程中，需要重点考虑以下几个方面。

1. 培养条件：BEVs的分泌量受各种理化因素影响，为特定菌株选择适宜的培养条件至关重要。此外，通过对培养条件进行适当调整，有助于改变BEVs产量。先前的研究表明，在压力选择下，细菌会对环境变化做出反应［10-13］，增加BEVs产量，具体包括：（1）铁缺乏：培养基中的铁缺乏可能导致某些菌株的BEVs产量增加，伴BEVs蛋白水平增高，例如在幽门螺杆菌中，OMVs相关毒力因子表达增加，包膜组成发生变化［14］；（2）氧化应激：当铜绿假单胞菌暴露于过氧化氢时，OMVs分泌量显著增加［15］。目前，人们正使用此方法大量生产BEVs以进行疫苗开发；（3）温度应激：恶臭假单胞菌暴露于55 ℃高温OMVs产量显著增加；而粘质沙雷氏菌趋势恰恰相反，即在低温（22 ℃和30 ℃）下OMVs产量增加，高温（37 ℃）下产量反而最少［16, 17］；（4）其他诱导方法：高渗透溶液（2 mol/L NaCl）、离子螯合剂（EDTA）和有机溶剂（1-辛醇）的使用可以增加恶臭假单胞菌OMVs产量。细胞壁生物合成阻滞剂d-环丝氨酸和靶向外膜的抗菌肽多黏菌素B可以导致铜绿假单胞菌OMVs分泌增加［15, 16］。然而，在干预BEVs产生时，需要注意这些化合物可能会导致BEVs的破坏；（5）此外，还可以通过对母细菌进行基因操作，如基因敲除或诱导突变，调节BEVs生成过程，增加BEVs分泌量［17-19］。

2. 菌株代数和生长时期：反复培养的菌株产生的BEVs在颗粒浓度和携载物质方面可能与原始菌株的BEVs存在差异，导致其发挥的生物学功能变异，且处于不同生长时期的细菌的BEVs分泌量也可能不同。一般情况下，应使用5代内菌株，在对数生长期进行BEVs分离［20］。但部分细菌，如铜绿假单胞菌、新凶手弗朗西斯菌等，相较于对数生长期，于稳定期分离的BEVs粒子浓度明显更高［21, 22］。在比较不同菌株或不同培养条件下的BEVs物质组成与生物活性之前，必须首先确定细菌生长曲线，即便不同菌株需要不同的孵育时间才能达到最佳光密度，也应在相同的生长阶段收集培养上清。

3. 质量控制：当对BEVs进行粒子浓度测定以量化BEVs产量时，建议使用细菌数来归一化。此外，相关研究表明，培养基（如常用于细菌培养的脑心浸出液肉汤）中含有大量细胞外囊泡（extracellular vesicle，EVs）样纳米颗粒，这些污染成分极大程度上影响了BEVs分离纯度与组学分析，因此，有必要采取超滤等手段，在细菌培养前且不影响BEVs分泌特性的前提下，预先去除培养基中的外源性干扰物质［23］。在进行下游分析时，最好同时设置空白培养基对照以评估干扰成分影响。

4. 离心过程：细菌培养液推荐使用差速离心法进行菌株和上清液的初次分离［24-26］，如2 000×g~10 000×g（4 ℃），去除细菌及细菌碎片，然后将收集的上清液经0.22 μm滤器过滤进一步去除残余细菌，转移到新的容器中以备BEVs分离。差速离心时应注意选择合适的离心速度，以防速度过高导致细菌破裂，内容物释放，影响BEVs纯度［27］。

推荐意见3：在扩大培养菌株时，应注意避免污染，根据不同菌株选择特定的培养条件，评估菌株的代数，并在适宜的生长时间收集细菌培养液，计算细菌数以便后续量化BEVs产量；采用差速离心法进行预处理。（证据质量：高；推荐等级：强推荐）

二、生物体液

BEVs存在于人体多种生物体液中，如血液、尿液、唾液、鼻腔分泌物、乳汁、支气管肺泡灌洗液、胆汁等，每种生物体液都具有特定的生物物理和化学特性，大大增加了BEVs分离的复杂性。此外，样本收集和前处理的方法可能会在很大程度上影响细菌丰度和BEVs回收率，进而影响后续BEVs组学和功能分析。为了实现更准确、高效的BEVs分析，亟需建立从复杂生物体液样本中分离BEVs 的标准化策略，其中，样本收集和前处理是至关重要的环节。

在前处理阶段，生物体液的黏度、体积和处理模式是关键因素［28-33］。这些因素决定了样品的稀释倍数、适用的离心转子或其他浓缩设备的选择，以及去除干扰成分的效率，进而影响BEVs分离纯度和回收率。另外，工作组推荐使用0.22 μm滤膜对样本前处理后的上清液进行过滤，以去除残留的细菌。同时，保证全程无菌操作，确保研究的主体是BEVs而不是细菌。然而，在前处理过程中降低真核细胞衍生的细胞外囊泡（eukaryotic extracellular vesicle，EEVs）这一干扰物质的丰度几乎难以实现，这就对BEVs的分离策略提出了更高要求。由于尚无涵盖所有BEVs专用研究的共识，因此，工作组建议遵循有关生物体液收集和前处理的一般建议，如临床和实验室标准协会相关指南（H21-A5、H03-A6、GP16-A2）。另外，由于EEVs与BEVs在结构上存在相似性、在尺寸和密度方面具有相近性，因而还可以参考国际细胞外囊泡学会（International Society for Extracellular Vesicles，ISEV）制定的关于EEVs研究的立场文件［34-37］。特定样本的收集和前处理方案见表2、3。

推荐意见4：不同的生物体液具有不同的理化特性，样本黏度、体积和处理模式决定了BEVs分离回收率和纯度，应针对不同的生物体液样本选择适宜的前处理方法。（证据质量：高；推荐等级：强推荐）

三、粪便

肠道是人体微生物群落的主要栖息地，粪便是最常用的研究肠道细菌BEVs的生物样本来源［53］。与上述其他生物体液一样，制定针对粪便的标准操作程序，包括样本采集、运输、前处理和存储方式等，对于提高BEVs分离或分析准确性、重复性和稳定性也至关重要。

根据粪便从收集到在实验室内处理的不同间隔时间（4或24 h内），推荐遵循不同的国际人类微生物组标准联盟指南进行样品采集（http：//www.microbiome-standards.org/）。采样工具可以结合受试者的偏好以及以往研究或预实验的BEVs分析结果进行选择和评估。当粪便标本运输到实验室后，可以分装、称重并将其悬浮在无菌溶液，如磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）中。相关研究表示粪便样本的稀释比例最好不超过10% 的质量浓度（质量/体积，w/v），以防止过饱和而造成样本资源浪费。未能及时处理的样本应冻存于-80 ℃［32，54, 55］。稀释后的粪便标本应在4 ℃震摇数小时或浸泡更长时间，直到粪便内容物完全悬浮于溶液中，需注意评估并选择合适的摇动频率和强度，以防止细菌菌体破裂［56］。之后，可以通过差速离心处理去除粪便悬浮液中的粗纤维、细菌等成分，在此过程中，应详细记录离心时间、离心力和温度等参数，以便于评估不同参数对BEVs回收率和纯度的影响，增加不同研究之间的可比性。

推荐意见5：粪便样本应充分悬浮在缓冲溶液中，再使用差速离心法去除粗纤维、细菌等干扰成分。样本稀释比例（w/v）影响BEVs回收率和纯度，评估并选择合适的比例至关重要。（证据质量：高；推荐等级：强推荐）

四、组织

组织BEVs的高效分离对于感染创口和肿瘤组织等的微生物群研究至关重要。目前，针对组织BEVs分离的研究相对较少，大多数研究侧重于从组织中分离总EVs，不仅包括BEVs，也包括EEVs［57］。针对组织的前处理方法因样本类型而异，不同组织在质地、间质成分和血液丰度等方面存在差异，因此需要基于下游分析目的对不同样本的前处理方案进行优化。主要考虑的因素包括解离方法，酶的类型、浓度、孵育时间，过滤器孔径，差速离心时间和离心力［58］。组织前处理的一般策略如下，即将新鲜提取的组织切成小块，然后通过机械力或酶处理进行均质化，再通过网孔过滤器（如70 μm）过滤获得单细胞悬液，最后差速离心去除凋亡小体或细胞碎片，获得的上清经0.22 μm滤膜过滤后，可存储于-80 ℃，或直接进行BEVs分离［59-62］。

推荐意见6：组织BEVs研究优先使用新鲜组织样本。使用机械力或酶对组织进行温和、充分地解离，应注意评估不同酶类型、浓度与作用时间对BEVs分离纯度、回收率和完整性的影响。（证据质量：中；推荐等级：弱推荐）

BEVs的分离

一、分离方法和注意事项

常用的BEVs分离方法包括：超速离心法、密度梯度离心法、超滤法、尺寸排阻色谱法、切向流过滤法、聚乙二醇沉淀法、免疫磁珠分离法、微流控技术和基于适配体的磁分离法［63］。

（一）离心法

离心法是根据BEVs与细菌、蛋白聚集体、脂质成分等在溶液中沉降系数的相对差异，利用不同的离心力和离心时间实现BEVs的分离。

1. 超速离心法（ultracentrifugation，UC）：该方法是EEVs分离的“金标准”法［64］，在近些年研究中也不断被用来分离BEVs，通过低速离心（<10 000×g）去除细菌和细菌碎片，再增大离心力（10 000×g~20 000×g）去除碎片和大囊泡，在此基础上，再以100 000×g的超高速离心（60~90 min）收取沉淀获得样本中的BEVs［65-68］。UC法分离BEVs的效率还与离心力、转子类型以及样品的黏度等因素息息相关，因此在BEVs分离过程中，应当根据样本类型适当调整离心参数，以获得高纯度的BEVs［69-71］。

2. 密度梯度离心法（density gradient centrifugation，DGC）：该方法是在UC法的基础上，通过长时间的离心（7~18 h），并添加一定浓度的分离媒介，如蔗糖和碘克沙醇等，根据BEVs与其他生物分子不同的粒径、分子量大小及密度差异实现高纯度分离，达到进一步去除EEVs、蛋白质聚集体和非膜性颗粒的目的［32，56，72, 73］。该方法分离纯度高，减小离心力对BEVs的破坏，适用于进行BEVs的功能学研究、标志物检测以及内容物的分析［74］。

3. 注意事项及建议：（1）每一种属的菌和不同生长条件下培养的菌株，对离心力的耐受程度可能不一致，前期的差速离心处理应针对不同的菌株类型和研究内容进行条件摸索，再通过后续的检测（如粒子浓度、标志物含量）验证BEVs的最大得率。与EEVs前处理所需低速离心不同的是，BEVs前处理的离心力可达5 000×g以上，且因细菌形态各异，离心力也应有所调整，以保证最大的BEVs得率，最小的细菌碎片污染率［75-77］。（2）复杂基质（如生物体液、粪便、组织）中EEVs的共分离仍然是BEVs研究面临的一项重大挑战，已有文献证实，BEVs的密度比EEVs大，EEVs密度一般在1.083~1.111 g/ml，而BEVs的密度一般>1.111 g/ml，这一特性使得BEVs主要集中在浓度为30%~35%的蔗糖或碘克沙醇中，但要从复杂基质中彻底排除EEVs的污染，特异性的分选方法或联合方法应纳入考虑［78, 79］。

（二）粒径分离法

粒径分离法是通过BEVs与其他生物大分子的粒径大小不同而实现分离的方法。

1. 超滤法（ultrafiltration，UF）：是目前最常用和最经济的粒径分离法之一，主要利用不同孔径大小和截留分子量的膜过滤器，使大于截留分子量的颗粒留下，而小于截留分子量的颗粒通过低速离心被遗弃。UF法不需要昂贵的设备，但所能过滤的体积较小，所以目前对于尿液［80］、胸腔积液、腹腔积液等小体积样本具有较高的提取率，但滤膜的堵塞和损坏会使得BEVs的回收率大幅度降低，而离心带来的挤压又会破坏BEVs的结构和形态。

2. 尺寸排阻色谱法（size-exclusion chromatography，SEC）：是根据不同粒径的分子通过多孔聚合物凝胶填料过程的不同速度来分离不同粒径颗粒的方法。只有直径小于孔径的成分才能进入多孔凝胶，样品中不同大小的分子会以不同的速度从色谱柱中洗脱出来。小分子可以进入凝胶中的小孔，在色谱柱中滞留时间更长，洗脱速度更慢，因此可以用于分离不同分子大小的样品。目前，这种方法可能适用于BEVs功能研究、标记鉴定和内容物分析。但由于SEC负载量有限，它只适合从血浆、血清和唾液等低容量样本中分离BEVs［81-84］。

3. 切向流过滤法（tangential flow filtration，TFF）：该方法是过滤技术的一种，其与UF法和SEC法不同的是分离液体移动的方向与膜的过滤方向垂直，溶液和BEVs进行分离时不用受到流体的垂直挤压，而是通过轻柔的切向作用流过分离界面，使BEVs等柔性结构免受挤压带来的破坏，对BEVs的膜完整性具有保护作用，是其他膜过滤技术所不具备的优势［85］。后续选择性进行结合-洗脱的体积排阻层析，可针对特定的细菌培养上清获得高产量的BEVs，并弥补膜过滤技术对大体积样本通量不足的缺陷，获得更高的分离效率并降低经济成本，克服目前离心法设备昂贵的问题，可为临床应用和获得高纯度的BEVs提供硬件支持［86］。

EEVs通用的生物标志物主要为CD63、CD81、CD9、Alix、TSG101和Syntenin-1等，而排除标记物为calnexin（也称为CANX）。但BEVs的生物标志物应根据不同的菌属进行筛选，而选用通用的LPS和LTA作为标志物时应注意排除结合LPS的EEVs的污染［121］。

推荐意见10：目前尚无通用的BEVs标志物，可以通过组成BEVs的脂质成分、外膜蛋白、特定基因及特殊蛋白对不同来源的BEVs进行鉴定。（证据质量：低；推荐等级：专家建议）

BEVs的下游分析

BEVs几乎拥有来自供体细胞的所有生物分子类型，即DNA、RNA、蛋白质、脂质或代谢物，对其下游各组分的分析有助于了解细菌与细菌、细菌与宿主间的作用过程。

一、核酸组学分析

BEVs有多种形式的核酸，包括RNA、DNA。目前，基于RNA测序、逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）等技术，人们发现BEVs中的RNA主要包括核糖体RNA、转运RNA、mRNA和小RNA等［122］。相关研究表明，牙龈卟啉单胞菌OMVs携载微小RNA大小的sRNA（microRNA-size small RNA，msRNA），调控牙周韧带细胞DNA甲基化，诱导细胞凋亡，进而导致牙周炎发生［123］。此外，通过16S rRNA基因测序等手段，研究者可以探析不同类型的生物体液中BEVs种类与相对丰度在健康或疾病状态下的动态变化规律，进而有助于阐明BEVs在生理病理过程中发挥的关键作用，为疾病的诊疗开拓新的方向［124］。PCR等实验证实，高毒力K. pneumoniae可以通过OMVs介导毒力基因转移到经典K. pneumoniae，导致其毒力表达水平增强［68］。综上，对BEVs核酸组分的分析，是深入了解细菌与宿主间的互作过程的重要手段。BEVs的常用核酸检测技术具体优势和局限性见表5。

推荐意见12：BEVs脂质组学分析推荐使用LC-MS/MS法，并根据研究目的来确定进行靶向或非靶向分析，特定脂质定性或定量可选用靶向分析，未知成分采用非靶向分析。（证据质量：高；推荐等级：强推荐）

三、BEVs蛋白质组学分析

研究表明，微生物囊泡可以携带多种蛋白质［130］，例如，高毒力高耐药肺炎克雷伯菌来源的OMVs携带多种功能蛋白，包括铁转运蛋白、碳青霉烯酶等成分［68］，与细菌作用机制密切相关。鉴定BEVs中携带的蛋白质对于研究细菌致病、遗传等机制以及疾病的早期诊断和治疗尤为重要。尽管已经有技术可以去除可溶性沉淀物，但这些技术目前仍无法应用于BEVs蛋白质组学分析中。根据BEVs蛋白质组学分析的研究目标不同，蛋白质组学分析可以分为靶向和非靶向蛋白质组学。靶向蛋白质组学主要是针对已知或特定的蛋白质进行研究，而非靶向蛋白质组学，则主要是检测尽可能多的蛋白质。相较于非靶向蛋白质组学，靶向蛋白质组学有更好的准确性、灵敏度和重现性。

蛋白质组学分析技术有很多种，但哪种技术最适合BEVs蛋白质组学分析尚无明确的建议。当前研究中最常用的BEVs蛋白质组学分析方法是质谱法，它已经被应用于病原体的致病性和免疫反应［131］、抗生素耐药性［132］等不同的研究方向。在应用质谱法进行蛋白质组学分析时，常用的靶向定量蛋白质组学质谱技术是基于选择反应监测（selected reaction monitoring，SRM）和平行反应监测（parallel reaction monitoring，PRM）扫描模式进行的，非靶向定量蛋白质组学技术主要是基于数据依赖型采集模式（data dependent acquisition，DDA）和数据非依赖型采集模式（data independent acquisition，DIA）进行的，而除了质谱法以外，其他技术也可用于BEVs的蛋白质组学分析，如基于核酸适配体的检测技术、邻位延伸技术、低密度阵列分析、基于免疫亲和的分析技术（高分辨率流式细胞术、芯片/平板的检测技术分析等）。这些方法的优点和局限性见表6。

推荐意见13：BEVs蛋白质组学分析推荐使用质谱法，并根据研究蛋白是否已知，选择SRM/PRM或DDA/DIA模式。（证据质量：高；推荐等级：强推荐）

四、BEVs代谢组学分析

BEVs含有调节靶细胞功能的代谢物和效应分子。特定的代谢物类型与BEVs亲本细菌类型有关。例如，多形拟杆菌OMVs显著富集了小鼠可消化代谢物和已被证实与菌株胃肠道生态位定植相关的代谢物［138］。产肠毒素的脆弱拟杆菌和不产肠毒素的脆弱拟杆菌OMVs中富含的代谢物种类与含量具有显著差异，提示其具有不同的代谢活性并参与不同的代谢途径［139］。需要注意的是，由于BEVs中的许多代谢物具有不同的化学性质，这意味着没有一种方法可以同时分析所有代谢物。

推荐意见14：对于未知的代谢物分子，推荐使用非靶向代谢组学，而特定一类代谢物的研究，推荐使用靶向代谢组，并利用生物信息库数据进行验证。（证据质量：高；推荐等级：强推荐）

五、BEVs下游相关生物信息学和数据库

由于目前还没有建立专门针对BEVs数据库，因此可以利用已有EVs的生物信息数据库，它们提供的信息包括核酸、蛋白质和物种来源（细菌、真菌和细胞），根据这种综合性数据库进行分析和调研，从而挖掘出样本中的囊泡是否含有细菌的成分，为BEVs的分析提供依据。常用的EVs相关综合性生物信息学数据库包括以下3种，在BEVs生物学功能的相关研究中，可以结合以下3种综合数据库信息进行分析。

1. ExoCarta数据库：ExoCarta数据库是首个EVs标志物综合数据库（http：//www.exocarta.org），收录了包括人、大鼠、小鼠、兔、绵羊、豚鼠、果蝇、马、牛等多个物种来源的蛋白质、RNA和脂质数据的资源［140］。在对膀胱癌EVs的蛋白质组学分析研究中，鉴定出353种蛋白组分，其中72种蛋白质以前未被其他人类EVs蛋白质组学鉴定，研究人员利用ExoCarta数据库，将该数据集与以前的EVs蛋白质组学研究进行比对，分析显示鉴定出的蛋白质组与癌源EVs的蛋白质组高度重叠［141］。

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