纳米孔测序技术创新与规范化应用专家共识（2025年）

《海军军医大学学报》网络首发论文

题目:

纳米孔测序技术创新与规范化应用专家共识(2025年)

作者:

《纳米孔测序技术创新与规范化应用专家共识0年》编写专家委员会

DOI:

10.16781/j.CN31-2187/R.20250888

网络首发日期:

2025-12-29

引用格式:

《纳米孔测序技术创新与规范化应用专家共识0年》编写专家委员会.纳米孔测序技术创新与规范化应用专家共识(2025年)[J/OL].海军军医大学学报. https://doi.org/10.16781/j.CN31-2187/R.20250888

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规范与共识

纳米孔测序技术创新与规范化应用专家共识（2025 年）

《纳米孔测序技术创新与规范化应用专家共识（2025 年）》编写专家委员会

摘要 纳米孔测序技术凭借其长读长、实时分析、直接测序及便携性等优势，在病原诊断和精准医学展现出巨大的应用潜力。然而，该技术在临床转化过程中仍面临实验流程标准化、数据分析规范化及结果解读一致性等挑战。本共识基于最新的科学研究和循证医学证据，围绕病原微生物快速检测、精准诊断应用、规范化流程与质量控制三个维度，阐述了纳米孔测序技术的适宜应用范围和技术规范性要求。共识强调了该技术在急危重症感染诊断、微生物耐药基因检测、核酸大片段变异识别和甲基化分析中的应用价值，并对实验室条件、实验操作及生物信息学分析流程提出了建议和展望，旨在为推动纳米孔测序技术创新和合理应用提供专业意见和积极建议。

关键词 纳米孔测序；临床应用；病原诊断；标准化流程；长读长测序

DOI: 10.16781/j.CN31-2187/R.20250888

Expert consensus on innovation and standardized application of nanopore sequencing technology

Committee on Expert Consensus on Innovation and Standardized Application of Nanopore Sequencing Technology

Abstract Nanopore sequencing technology, featured by its long read lengths, real-time analysis, direct sequencing capabilities, and high portability, demonstrates immense potential in pathogen diagnosis and precision medicine. However, clinical translation remains constrained by challenges regarding the standardization of exper imental protocols, data analysis pipelines, and the consistency of result interpretation. Based on the latest scientific research and evidence -based medicine, this consensus addresses three aspects: the rapid detection of pathogenic microorganisms, applica tions in precision diagnosis, and the establishment of standardized procedures and quality control. Specifically, it delineates the technology's critical value in the diagnosis of acute and critical infections, microbial resistance gene detection, identification of large nucleic acid fragment variations, and methylation analysis. This consensus also provides suggestions and prospects for laboratory conditions, experimental operations, and bioinformatics analysis processes, aiming to foster the innovation an d rational application of nanopore sequencing technology.

Key words nanopore sequencing; clinical application; pathogen diagnosis; standardized workflow; long -read sequencing

1 背景与概述

1.1 技术背景

纳米孔测序（nanopore sequencing）技术原理基于电泳生物传感机制，即在电压驱动下，核酸分子（DNA 或 RNA）以单链形式穿过嵌合在电阻性聚合物膜上的纳米级生物或固态孔道，通过高频采样记录不同碱基穿孔时引起的特征性电流阻断信号，并利用深度学习算法实时解码出序列信息 [1]。与传统二代高通量测序相比，纳米孔测序可不依赖 PCR 扩增或化学标记[2]，不仅避免了扩增偏倚，还能直接检测甲基化等修饰碱基[3]。

相对于 PacBio 等长度长技术平台，纳米孔测序仪构造简单、体积小巧且方便移动[2,4]，具备“边测序边分析”的实时数据产出能力，允许用户在获得有效结果后中止测序，并通过芯片清洗实现重复利用，从而降低了单次运行成本并扩展了现场检测等应用场景。该技术另一个优势在于可获得 Mb 级

网络首发时间：

网络首发地址：

2025-12-29 13:17:15

https://link.cnki.net/urlid/31.2187.R.20251229.1204.001

的超长读长[5]，提升了基因组拼接、组装及结构变异检测的效率。此外，为了克服纳米孔测序在单碱基准确率和同聚物分辨上的挑战，研究人员探索了独特的优化路径，例如结合了生物纳米孔与化学合成优势的“NanoTag”技术，纳米孔边合成边测序（nanopore sequencing by synthesis, NSS）。这些技术积累和改进为纳米孔测序技术的实践应用奠定了必要的基础。

1.2 临床应用现状与挑战

在当前的临床实践中，感染性疾病的病原诊断常面临“速度慢”和“检不出”的痛点。传统培养结合质谱鉴定的方法仍耗时较长，且对苛养菌、病毒及真菌的阳性率低（血培养阳性率通常<40%）[6]；二代测序虽然具备通量高、成本日益下降的优势，但建库流程相对烦琐、检测周转周期（turn-around time, TAT）较长且难以解析复杂的耐药序列。此外，基因片段的融合和复杂的染色体结构变异（structural variations, SVs）改变往往是某些疾病表型的关键驱动因素，诸多分子标志物和潜在规律难以通过二代测序方法发现和揭示。

纳米孔测序平台可以不依赖体积庞大、环境要求严苛的配套仪器，仅凭手持大小的设备即可在资源受限的实验室甚至野外环境开展作业。纳米孔测序具备“边测序边读取”的能力，能够在较短时间输出和识别关键数据，为缩短样本到结果的周转时间提供便利。纳米孔测序平台的优势对于急重症感染快速病原学诊断、新发突发疫情病原体筛查鉴定等场景具有重要的应用价值。此外，结合生物信息学分析，纳米孔测序技术还为精准捕捉 SVs[7]、甲基化修饰和耐药基因[8]等分子特征提供了候选解决方案。

尽管优势明显，目前纳米孔测序的技术创新仍然存在一些瓶颈问题亟待突破，比如纳米孔道阻塞、测序单次读取准确率和重复序列识别错误率较高等，而且在实际应用和临床转化中也面临实验流程标准化、数据分析规范化及结果解读一致性等挑战。这些问题的存在也一定程度上制约了相关的设备和试剂获得医疗器械注册准入进程，亟需行业内专家和从业人员凝聚共识，进一步推动技术革新和规范化应用。

1.3 共识目的

本共识汇聚多学科专家意见，结合国内外最新研究成果与相关团体标准，旨在强化纳米孔测序技术创新方向，明确在不同场景下的应用价值与推荐等级，为规范化应用提供指引和依据。

2 感染性疾病病原体快速检测

2.1 病原体感染的快速诊断

病原微生物的快速、精准鉴定对指导抗感染治疗、降低死亡率至关重要。脓毒症患者每延迟 1 h有效抗生素治疗，其生存率即下降 7.6%[9]。对于脓毒症、重症肺炎或中枢神经系统感染的患者，传统培养方法耗时长且阳性率较低，而纳米孔测序可快速对鼻咽分泌物、肺泡灌洗液、血液、脑脊液、尿液、感染性渗出液等样本进行检测。

2.1.1 呼吸道感染

呼吸道样本中宿主 DNA 背景较高，常导致微生物序列占比偏低。采用皂苷法等宿主 DNA 去除方法处理支气管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid, BALF）样本后，进行纳米孔测序，可显著提高微生物信号比例（从 1%提升至 48%）[10]，从而提高病原体检出率。

为确保纳米孔测序在低丰度病原体检测中的性能，样本类型的选择至关重要。在采集呼吸道标本进行非结核分枝杆菌的纳米孔靶向测序检测时，优先推荐使用 BALF 样本，因其检测敏感性最高（90.1%），其次为痰液（78.6%），而肺穿刺液敏感性较低（50.0%），因此开展呼吸道样本纳米孔检测前优先推荐 BALF 和痰液以充分发挥实时快速检测的效能，并对低质量样本检出的阴性结果审慎判读[11]。

此外，针对呼吸道感染中传统培养方法难以检出的真菌病原体，纳米孔测序展现出显著优势。在重症或免疫受损患者中，曲霉、地方性真菌（如组织胞浆菌）及耶氏肺孢子菌的早期识别是临床痛

点[12]。纳米孔测序的长读长特性可以直接跨越真菌基因组的复杂重复区域，实现对上述苛养或生长缓慢真菌的快速精准鉴定，有效弥补常规检测方法的不足。

呼吸道病原体监测中，单一病原体检测往往会遗漏合并感染。有学者提出“双流程”（dualprocess）策略[13]，即结合纳米孔靶向测序和无偏倚宏基因组测序，相比单一方法，该策略在诊断复杂下呼吸道感染时能显著提高病毒和曲霉菌的检出率。在 COVID-19 患者中，纳米孔测序（如 RespiCoV 方案[14]）不仅能与 rRT-PCR 高度一致地检出 SARS-CoV-2，还能在 24.7%的阴性样本中检出流感病毒、腺病毒等合并感染[15]。

需注意的是，实验室报告提供的菌种相对丰度、测序深度及覆盖度等指标，仅作为微生物学线索，临床医生应结合患者的具体临床症状（临床肺部感染 CPIS 评分、影像学）进行综合判读，以区分定植菌与致病菌[16]，从而指导抗感染决策。

推荐意见 1：对于呼吸道感染患者的样本（如支气管肺泡灌洗液），尤其是免疫功能低下或病情危重者，建议采用纳米孔靶向测序或纳米孔宏基因组测序作为补充诊断手段以避免遗漏混合感染，诊断策略的选择应综合考虑诊断目的、目标人群特点、医疗资源可及性以及患者具体情况（证据等级：Ⅱa 级；推荐等级：条件推荐）。

2.1.2 血流感染

临床上，感染性疾病传统诊断路径时常受制于检测反馈周期，导致广谱抗生素的使用依据不够充分。常规血培养、菌种鉴定和药敏试验平均需要 2~3 d。经流程优化后，纳米孔靶向测序从血培养阳性产物至报告输出的全过程可在 6~16 h 左右完成[17-19]，为急诊和 ICU 患者提供更及时的病原学依据，指导治疗方案选择。

前瞻性队列研究（n=387）显示，纳米孔靶向测序对血流感染（bloodstream infection, BSI）的检出阳性率为 69.5%，显著高于传统血培养（ 33.9%，P<0.01），其诊断 BSI 的灵敏度为 84.0%（95%CI: 79.5%~87.7%），特异性达 90.1%[20]。除常见细菌外，纳米孔靶向测序还扩展了病原谱筛查范围，不仅提高了对毛霉目等苛养/生长缓慢真菌的检出能力，还能同步识别常规血培养无法涵盖的病毒（如 EB 病毒）及非典型病原体（如恙虫病东方体）[20-22]。

临床策略选择上，对于疑似非罕见病原感染（如常见革兰阴性杆菌、葡萄球菌），推荐使用多重 PCR 扩增的纳米孔靶向测序，以兼顾检测灵敏度与成本控制；对于不明原因的复杂感染，推荐使用纳米孔宏基因组测序，然而，由于宏基因组测序易检出非急性血流感染致病微生物，结果解读需审慎。

对于血培养阴性但高度疑似的病例，纳米孔游离 DNA（cell-free DNA, cfDNA）测序可作为补充诊断手段识别其他相关感染[23]。

虽然非规模化量产纳米孔测序相关试剂耗材在临床病原微生物鉴定中的成本相对较高，但其高灵敏度和快速诊断优势可能通过降低死亡率、缩短住院时间，为特定脆弱、高危患者群体带来临床获益，该价值有待更大规模前瞻性研究进一步验证。

推荐意见 2：对于疑似 BSI 的危重患者，需要快速病原体识别或传统血培养结果阴性时，建议采用纳米孔靶向测序作为辅助诊断工具，对于不明原因的复杂、疑难或罕见感染，推荐使用纳米孔宏基因组测序（证据等级：ⅠIa 级；推荐等级：强推荐）。

2.1.3 中枢神经系统感染

中枢神经系统（central nervous system, CNS）感染样本（脑脊液）中病原载量通常极低，且病原谱复杂（涵盖细菌、病毒、真菌、寄生虫），传统培养和脑膜炎/脑炎检测试剂盒覆盖范围有限。

研究表明，纳米孔测序可作为培养阴性细菌性脑膜炎病例的重要补充，提高病原学诊断率[24]。一项针对中枢神经系统感染开发的纳米孔靶向测序能准确检测 17 种常见病原体，检测限低至 102 CFU/mL，且与二代测序的宏基因组测序结果高度一致，报告周期可缩短至 8 h[25]。

推荐意见 3：对于常规检测方法未能确诊的疑似中枢神经系统感染（如脑膜炎、脑炎）患者，建议采用纳米孔靶向测序或宏基因组测序进行脑脊液检测（证据等级：Ⅱa 级；推荐等级：条件推荐）。

2.1.4 新发突发疫情的现场检测

面对新发突发疫情，检测时效性至关重要，由于现场条件受限，这是纳米孔测序技术最为适宜的应用场景。研究表明，利用纳米孔测序设备结合多重 PCR 扩增子测序，可在采样后 8 h 获得近乎完整的汉坦病毒基因组[26]，为快速诊断和防控决策提供依据。同时，对于低丰度、高致病性或涉及重大治疗决策的变异/病原体，建议使用 Sanger 测序或 qPCR 等正交技术进行验证[27]。

针对 SARS-CoV-2，纳米孔测序设备因其便携、低成本及快速周转的特性，成为常规诊断的有效补充[28]。扩增子测序（family-wide PCR and nanopore sequencing of amplicons, FP-NSA）方法结合便携式纳米孔测序设备，可在 4 h 内完成对流感病毒及冠状病毒（含 SARS-CoV-2）的检测[29]，该方法适用于疾病流行地区的病原体现场监测。

推荐意见 4：在疫情地区、方舱医院或资源受限的现场，采用 PCR 法对已知病原进行诊断的同时，推荐使用基于纳米孔测序技术的移动检测平台对样本进行病原体筛查鉴定、初步溯源和谱系鉴定，为早期防控提供参考（证据等级：Ⅱb 级；推荐等级：强推荐）。

在预设场景演练中，纳米孔测序仪可以成功检测出双盲样本中的所有目标病原体（包括炭疽杆菌、鼠疫耶尔森菌近缘种等），显示了该技术在疫情现场应急响应中的作用。研究提示，无 PCR 的快速建库方法在菌群相对丰度偏离上最小[30]，因此对于病原核酸载量高且背景核酸量低的情况下可推荐采用非扩增建库测序流程。

2.2 耐药基因与质粒检测

耐药菌的快速识别对指导抗生素精准使用至关重要，短读长测序往往难以判断耐药基因在细菌内部的定位，也难以确定其宿主归属，而纳米孔测序的技术优势有助于解决这一问题。

2.2.1 识别关键耐药基因

多项研究表明，对阳性血培养物直接进行纳米孔测序，不仅能实现高效的物种识别准确率，且通过识别关键耐药基因所预测的耐药结果，与常规表型药敏试验的一致性可达 90%以上[22,31]。

纳米孔测序可用于检测碳青霉烯酶基因（如 blaNDM, blaKPC, blaOXA-48）、甲氧西林耐药基因（mecA）及万古霉素耐药基因（vanA/B）[32]。对于金黄色葡萄球菌，基于扩增子的纳米孔测序可在 10 min 内达到 3 000×以上的覆盖深度，灵敏检测万古霉素中介金葡菌（ vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus, VISA）相关突变（如 walK、graR）[33]。

需注意，耐药基因的存在与否不一定能够完全预测表型，后者受基因表达、基因拷贝数和翻译后修饰影响[34]。开展耐药基因检测前，建议就检测价值、局限性和费用等进行充分知情沟通。

推荐意见 5：在临床微生物实验室报告阳性血培养后，有条件下采用纳米孔靶向测序技术进行快速复核，精准鉴定病原体并同步预测关键耐药基因（如 blaKPC、mecA、vanA 等）（证据等级：III级；推荐等级：弱推荐）。后续仍需积累充分的临床验证数据，以建立健全耐药基因数据库和优化检测算法，进一步提高鉴定技术的灵敏度和特异度。

对于某些抗生素（如哌拉西林-他唑巴坦）或铜绿假单胞菌的耐药识别，目前仍存在一定的重大误差率（very major error, VME，即由耐药误判为敏感的严重错误） [19]，建议结合药敏结果综合判断。

2.2.2 解析耐药质粒的完整结构及传播机制

纳米孔测序的长度长优势有助于完整组装质粒序列，明确包含耐药基因的质粒图谱[35]。纳米孔测序可以识别插入序列介导的基因转移机制（如 IS6 家族介导 optrA 基因传播），区分耐药性是垂直传播（克隆扩增）还是水平转移（质粒接合）[36]，结合传统的药物敏感性试验等表型数据，对于判断感染溯源、制定防控措施具有重要意义。

推荐意见 6：对于多重耐药菌，特别是碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌，可利用纳米孔测序解析耐药质粒的完整结构及传播机制（证据等级：ⅡI 级；推荐等级：弱推荐）。

2.3 特殊病原体检测和变异株监测

对于生长缓慢（如分枝杆菌）、难以培养（如胞内菌）或生物安全风险高（如布鲁氏菌）的病原体，纳米孔测序技术提供了快速病原学确诊的新途径。

一项纳入 32 项研究的系统评价显示 [37]，纳米孔测序用于诊断结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, MTB）及其耐药性的综合性能优异，汇总灵敏度为 88.61%（95% CI 83.81%~92.12%），特异度 93.18%（95% CI 85.32%~96.98%），曲线下面积（area under the curve, AUC）达 0.932，这表明其作为结核病及其耐药性诊断工具具有很好的准确性。专门开发的基于纳米孔测序的 TBseq 方案（靶向扩增 M.tb 基因组中的特定区域）[38]在 829 例患者中对 MTB 的检测灵敏度（90.9%）和特异性（93.0%）均优于传统培养法和 Xpert MTB/RIF Ultra，还可同步检测 7 种一线及二线抗结核药物的耐药性，单样本测序成本约为 400 元，全流程 TAT 缩短至 16 h。针对条件有限的实验室，可以整合基于重组酶聚合酶扩增（recombinase polymerase amplification, RPA）的等温扩增与纳米孔测序平台[39]，以构建一套便携式分子诊断体系，从而在资源受限环境下实现病原体的快速筛查和鉴定。

推荐意见 7：在结核病高负担地区或疑似耐药结核病例中，建议将纳米孔靶向测序作为疑似结核感染样本的一线诊断工具之一，并持续优化技术流程以提升临床适用性（证据等级： Ⅰa 级；推荐等级：弱推荐）。

在加纳等疟疾流行区，基于纳米孔测序的监测平台适用于干血斑样本检测，可有效追踪 csp 基因多样性及抗疟药耐药标记[40]，为疫苗效果评估提供本地化数据。

针对不明原因发热或有蜱虫叮咬史的患者，纳米孔宏基因组测序能检出 PCR 常漏检的新发或罕见病毒。研究发现[41]，相比于传统的靶向 PCR，纳米孔宏基因组测序能更全面地揭示样本中的病毒群落（virome），成功检出了克里米亚-刚果出血热病毒和荆门蜱病毒等高致病性病毒，并提供了全基因组序列用于系统发育分析，提示其可能成为应对新发虫媒传染病早期预警的重要技术手段之一。

3 精准诊断

3.1 复杂结构变异(SVs)检测

人类基因组中存在大量的重复序列和复杂结构变异，二代测序的短读长难以跨越这些区域，常导致大片段结构变异漏检或组装错误。纳米孔测序可以检测二代测序难以覆盖的复杂基因组变异和表观遗传修饰，为肿瘤精准医疗和罕见病诊断提供了新手段。

纳米孔全基因组测序为我们提供了检测复杂 SVs 的新手段。与核型分析、荧光原位杂交（ fluorescence in situ hybridization, FISH）、染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis, CMA）及二代全外显子组测序（whole exome sequencing, WES）相比，纳米孔测序能够跨越重复区域和复杂断裂点，直接捕捉倒位、易位、大片段缺失等复杂 SVs 的完整结构[42-43]。多项临床样本验证显示，通过低深度（4~8×）纳米孔全基因组测序，复杂 SVs 的检出显著增加：例如在已知的复杂不平衡 SVs 中，纳米孔测序方法可检测出 83%（5/6）的变异，而常规核型或短读长测序常遗漏这些变异[44]；另有研究报道，纳米孔测序可在 1:100 稀释的样本中仍稳定检出倒位、易位等 SVs，提示其在低丰度变异中的检测优势[44]。

3.2 甲基化修饰检测

亚硫酸氢盐测序（bisulfite sequencing，BS-Seq）被称为甲基化检测的金标准，由于需要强烈的化学试剂处理，导致 DNA 严重降解，难以获取长片段信息[45]。

纳米孔原生（native）DNA/RNA 测序指在不经过 PCR 扩增和化学标记的情况下测定天然 DNA/RNA 分子，目前研究人员正在探索将纳米孔测序技术应用于基因组印记疾病（ genomic imprinting disorders，如 Temple 综合征）、结直肠癌、头颈癌等肿瘤的检测和精准诊断[46-47]。采用纳米孔原生 DNA/RNA 测序，无需亚硫酸氢盐处理，直接检测甲基化修饰[48-49]。纳米孔测序结果在甲基化图谱一致性方面与 BS‑Seq 结果高度一致（尤其在 CpG 岛、启动子区域）[50]，然而，鉴于肿瘤早筛

（尤其是液体活检）对低丰度肿瘤信号检测的高灵敏度要求，纳米孔测序在这一场景下的应用仍需审慎评估。尽管其检测成本显著低于传统方法，同时 DNA 起始量需求低（部分研究使用≥25 ng 的 FFPE样本或低至 0.1×覆盖度的全基因组甲基化检测即可完成[50]）等优势，但如何在大规模背景噪声中确保微量致病信号的稳定检出，仍是临床转化前亟待解决的关键挑战。

推荐意见 8：对于基因组印记病或肿瘤早筛样本的液体活检，纳米孔原生 DNA/RNA 测序可作为甲基化检测的有效替代或补充方案（证据等级：Ⅱb 级；推荐等级：条件推荐）。

3.3 其他疾病精准诊断相关应用

短串联重复序列（short tandem repeats, STR）是由 2~6 个碱基对作为核心单位重复排列而成的序列，与神经退行性疾病（如脊髓小脑性共济失调和脆性 X 综合征相关）之间存在着较强的致病关联。尽管二代测序在检测常规短片段 STR 方面表现优异，纳米孔测序能够直接获取长片段的 STR 区域 [51]，避免 PCR 扩增偏好性，并通过专用算法从原始信号中精确计算重复次数，其准确性与 Southern Blot 相当甚至更高，尤其在检测大片段扩展时更具可靠性[52-54]。在操作层面，纳米孔测序简化了工作流程，无需片段分离、杂交或毛细管电泳等繁琐步骤，实现从样本到结果的单步检测，可以降低实验复杂度与时间成本[55]。

目前，常规遗传检测对疑似单基因疾病的诊断率低于 50%[56]，主要受限于既往测序技术对 SVs、重复序列扩增及表观遗传改变等识别能力不足。多项研究表明，纳米孔测序可为约四分之一的未确诊遗传病患者提供明确病因 [57-59]。在香港基因组计划的前瞻性研究中，在二代测序已获得 24%（125/520）明确诊断的基础上，引入纳米孔测序可使确诊率提升 4%（21/520）[60]。这些研究表明，纳米孔测序有望为遗传病的精准诊断与产前检测提供新的技术手段。

4 实验室、平台和操作规范

4.1 实验室和现场检测条件要求

规范的实验室分区（试剂准备、样本制备、扩增/测序）是防止气溶胶污染、确保检测特异性的基础，特别是对于基于 PCR 扩增的纳米孔测序流程，极微量的扩增产物污染即可导致假阳性结果。

依据《医疗机构临床基因扩增检验实验室管理办法》 [61]及 GB 19489-2008《实验室生物安全通用要求》[62]，物理隔离和单向气流是标准配置，用于现场检测的移动实验室应额外满足环境适应性和稳定性要求。

在条件受限时，若实验流程涉及不可避免的开盖操作，必须充分评估生物安全风险。为提升操作的一致性与防污染能力，建议采用封闭式全自动工作站，通过整合连续、复杂的步骤于自动化平台，不仅能大幅降低人为误差，更能通过物理封闭最大程度隔绝气溶胶污染，从而确保实验结果可靠性。

针对野外、现场等即时测序场景，应建立相应的移动平台建设标准，例如配置一体化、封闭式的卡匣式工作站，并制定相应的环境监控与应急处理方案，以实现的全程污染可控检测。

推荐意见 9：开展纳米孔测序的实验室应符合生物安全通用要求，至少应包括试剂准备区、样本制备区、文库制备区及测序区，防止交叉污染。针对野外、现场等即时测序场景，应制定相应的移动平台建设标准（证据等级：Ia 级；推荐等级：强推荐）。

4.2 核酸提取与文库构建

样本质量直接决定测序读长和数据产出，核酸提取后的样本应在低温下（如-20 ℃或-80 ℃）按平台要求时限进行保存，以确保核酸的完整性与稳定性，最大程度保存完整核酸分子是实现长读长检测的先决条件。

研究表明，温和的提取方式（如磁珠法避免剧烈涡旋）可显著提高 N50 值，从而提升 SVs 检测灵敏度和基因组组装连续性[5]。然而，不同微生物类别的核酸释放效率差异显著，真菌和分枝杆菌等需要特定破壁处理。因此，对于疑似真菌或分枝杆菌感染的样本，应增加必要的预处理步骤，优化破壁效率与核酸分子保护[63]。

对于复杂临床样本，残留的污染物（如多糖、蛋白）会阻塞纳米孔，降低测序产量，因此需进行纯化处理。PCR-free 建库方法能保留核酸分子的修饰信息且无扩增偏好，适用于表观遗传学研究；而扩增子建库则适用于低载量病原体检测[64]。

推荐意见 10：对于拟开展纳米孔测序的样本，建议采用温和的核酸提取方法以保留长片段 DNA。针对复杂临床样本（如 BALF、福尔马林固定石蜡包埋样本），应优化提取工艺以去除杂质。

文库构建时，应根据应用场景选择合适的建库试剂盒（如 PCR-free 或扩增子建库），并严格控制连接效率和文库浓度（证据等级：Ib 级；推荐等级：强推荐）。

高通量测序（尤其是宏基因组测序）具有很高的灵敏度，容易受到“试剂组”（kitome）或环境背景微生物 DNA 的污染，导致假阳性结果。设置阴性对照（无模板对照）可以识别并去除背景噪声，对于低生物量样本（如脑脊液）尤为关键[65]。设置阳性对照（已知浓度的标准菌株或模拟样本）则用于监控核酸提取效率、文库构建成功率及测序过程的稳定性，确保检测系统的性能达标[66]。

推荐意见 11：在文库制备过程中，每个批次必须包含空白对照、阳性和阴性外部对照，以监控试剂污染及环境微生物干扰（证据等级：Ia 级；推荐等级：强推荐）。

4.3 数据分析与报告

4.3.1 纳米孔测序相关数据库构建

目前，适配纳米孔测序的参考资源体系已趋成熟，形成以美国国家生物技术信息中心（NCBI）RefSeq、CNCB-国家基因组科学数据中心（NGDC）为核心的综合性数据基座，并整合了 FDAARGOS、SILVA、CARD 等高质量专用数据库，以及 EPI2ME、Galaxy 等集成化云端分析平台[67]。

然而，现有资源仍面临数据库适配性不足、关键病原数据缺失、分类注释偏差及数据隐私标准不统一等瓶颈[68]。为了充分发挥纳米孔测序即时和现场测序的优势，亟需高质量参考基因组数据库为核心，叠加多维数据与云端标准化流程，通过版本化与本地化软件开发，实现快速的检出与功能注释，满足临床与现场应用[67]。

4.3.2 序列分析

纳米孔测序数据具有特有的误差模式（如同聚物和插入缺失误差），传统二代测序生物信息学分析工具不完全适用。Minimap2 是目前公认的针对长读长基因组 DNA 序列进行比对的金标准工具[69-70]，RNA 推荐使用 GMAP[71]，能有效处理长序列中的错误和剪接位点。随着 Guppy、Dorado 等碱基识别算法的迭代，纳米孔测序准确率已显著提升，但临床报告仍需设定严格的质控阈值（如 Q 值、序列覆盖度）。由于测序可能存在假阳性，对于临床决策至关重要的发现（如耐药基因、罕见突变），采用 Sanger 测序或 qPCR 进行正交验证是保障医疗安全的必要措施[72]。

4.3.3 质量控制措施

鉴于纳米孔测序虽具备长读长优势，但仍存在特定的系统性误差，如部分平台的同聚物测序噪声，亟需建立区分场景的精细化质控标准。

针对 SNV/Indel 检测，需重点监控碱基质量（base quality）及同聚物区域的读段一致性，设定严格的最小支持读段数与链偏倚阈值，避免测序结果错误；针对 SV/CNV 检测，质控核心应聚焦于断点的跨越读段证据与局部覆盖深度的一致性，据此确立可操作的样本放行标准[73]。此外，建议在生物信息分析流程中强化位点级过滤策略，综合利用变异丰度（variant allele frequency, VAF）、比对质量[74]，并构建基于健康人群的正常样本库（panel of normals, PoN）作为背景噪声模型[75]，从而在大规模候选变异中精准识别并剔除批次特异性或平台系统性的假阳性，确保临床报告的准确性与可靠性。

4.3.4 数据安全性和隐私保护

人类样本测序数据，尤其是长读长基因组数据，具有高度个体识别性，建议构建全流程的隐私保护与伦理合规体系。在采集端应确立知情同意的核心地位，确保受试者对数据用途的充分知情；存储与传输端须严格遵循数据本地化与跨境传输安全评估要求；使用端应厘清科研与商业利用的法律边

界，切实维护个人隐私权益[76-77]。

推荐意见 12：数据分析应采用经过验证的标准化流程；针对纳米孔测序技术的特点，应使用专门的碱基识别算法和比对工具；报告生成应结合测序深度、覆盖度、Q 值及临床背景进行综合解读；对于检出的致病变异或病原体，必要时应通过正交方法（如 Sanger 测序、qPCR）进行验证（证据等级：Ib 级；推荐等级：强推荐）。

4.4 性能确认

根据临床实验室改进修正案（Clinical Laboratory Improvement Amendments, CLIA）和美国病理学家协会（College of American Pathologists, CAP）等国际标准，以及中国《二代测序技术在肿瘤精准医学诊断中的应用专家共识》，任何实验室自建项目（laboratory developed test, LDT）在应用于临床前必须经过严格的方法学性能确认。使用公认的标准参考物质进行定期校准（如 NA12878[78-79]），可以客观评估测序平台的系统误差，监控测序仪状态随时间的变化，确保不同批次检测结果的一致性和可比性[80]。如出现系统误差、质控偏移、不明原因污染或数据失真等，应立即进行校正。应推动建立针对纳米孔测序平台的室内质量控制与室间质量评价标准，并鼓励实验室定期参与权威机构组织的室内质控或室间质评，保证对实验室检测性能的持续监测与验证。

推荐意见 13：实验室在开展临床检测前，必须对测序平台进行包括生信分析平台、分析性能和临床性能在内的全面确认，包括但不限于准确性、重复性、灵敏度（检测限）、特异性及抗干扰能力等（证据等级：Ia 级；推荐等级：强推荐）。

5 展 望

纳米孔测序技术的创新发展将通过多学科交叉创新，逐步突破精度、通量与稳定性之间所谓的“不可能三角”，实现从“可用”到“精准高效”的跨越。未来在在孔道工程方面，将不断优化纳米孔蛋白结构，并设计新型蛋白-固态复合孔，以平衡稳定性与信号分辨率，同时开发抗污染涂层和孔道阻塞自动清除技术。集成化传感系统将构建多模态传感平台，推动传感与信号处理一体化。算法与 AI 驱动方面，将利用深度学习直接从原始信号预测序列和修饰，减少中间步骤误差，同时开发轻量级算法以适配便携设备的边缘计算。此外，样本处理自动化将通过微流控芯片集成，实现“样本进 -结果出”的全自动测序。通过这些努力有望在多个核心瓶颈上取得实质性突破，使纳米孔测序设备实现更高的集成度、自动化与智能化。这将显著降低设备对使用环境与专业操作的依赖，使安全、快速、精准的测序能力得以延伸至现场、基层乃至资源有限地区，真正实现的即时检测与分析。

6 推荐强度与证据等级说明

6.1 强推荐

对于疑似 BSI 的危重患者，特别是当传统培养阴性或需要快速病原体识别时，建议应采用纳米孔靶向或宏基因组测序辅助诊断；在疫情地区、方舱医院或资源受限的现场，推荐使用基于纳米孔测序技术的移动检测平台对混合样本进行病原体筛查鉴定、初步溯源和谱系鉴定。开展纳米孔测序的实验室应符合生物安全要求，并严格划分功能区防止交叉污染；建议采用温和的核酸提取方法以保留长片段 DNA；针对复杂临床样本，应优化提取工艺以去除杂质；建议每批次设置完善的质控对照，在临床应用前必须通过全面的性能确认；在数据分析上，强调必须使用经验证的标准化流程及专门算法，并在必要时通过正交方法进行验证。

6.2 条件推荐

对于呼吸道感染患者的样本，尤其是免疫功能低下或病情危重者，建议根据诊断目的和资源情况，考虑将纳米孔靶向或宏基因组测序作为避免漏诊混合感染的补充手段。在常规方法未能确诊的疑似中枢神经系统感染中，也建议对脑脊液进行此类检测。此外，对于基因组印记病或肿瘤早筛样本的液体活检，纳米孔原生 DNA/RNA 测序被推荐作为甲基化检测的有效替代或补充方案。

《纳米孔测序技术创新与规范化应用专家共识(年)》编写专家委员会等纳米孔测序技术创新与规范化应用专家共识(2025年) 9

6.3 弱推荐

在临床微生物实验室报告阳性血培养后,有条件下采用纳米孔靶向测序技术进行快速复核,精准鉴定病原体并同步预测关键耐药基因;对于多重耐药菌,特别是碳青霉烯耐药肠杆菌科细菌,可利用纳米孔测序解析耐药质粒的完整结构及传播机制;在结核病高负担地区或疑似耐药结核病例中,建议将纳米孔靶向测序作为疑似结核感染样本的一线诊断工具之一,并持续优化技术流程以提升临床适用性。

6.4 依据 GRADE 系统进行证据等级分类

Ia/b: 随机对照试验(RCT)及其Meta分析;

IIa/b: 队列研究或低质量 RCT;

III: 病例对照或观察性研究;

IV: 专家意见或基础研究。

6.5 证据等级与推荐强度的关系

高证据质量(A)：即使证据质量高，也可能因为利弊不确定或患者价值观差异而给出弱推荐。

中等证据质量(B)：根据具体情况，可能给出强推荐或弱推荐。

低证据质量(C/D)：即使证据质量低，如果利大于弊且患者价值观一致，也可能给出强推荐。

7 利益冲突声明

本共识起草专家组成员声明无与本文内容相关的利益冲突。

本共识将根据技术发展和临床证据的更新进行动态修订,以持续指导临床实践。

8 缩略词表

|序号|英文简称|英文全称|中文含义| |---|---|---|---| |1|AUC|Area under the curve|曲线下面积| |2|BALF|Bronchoalveolar lavage fluid|支气管肺泡灌洗液| |3|BSI|Bloodstream infection|血流感染| |4|CAP|College of American Pathologists|美国病理学家协会| |5|cfDNA|Cell-free DNA|游离 DNA| |6|CLIA|Clinical laboratory improvement amendments|临床实验室改进修正案| |7|CMA|Chromosomal microarray analysis|染色体微阵列分析| |8|CNS|Central nervous system|中枢神经系统| |9|CNV|Copy number variation|拷贝数变异| |10|CPIS|Clinical pulmonary infection score|临床肺部感染评分| |11|EBV|Epstein-Barr virus|EB病毒(爱泼斯坦-巴尔病毒)| |12|FDA-ARGOS|FDA Antibiotic Resistance Ontology and System|FDA抗生素耐药本体与系统| |13|FISH|Fluorescence in situ hybridization|荧光原位杂交| |14|FP-NSA|Family-wide PCR and nanopore sequencing of amplicons|家族广谱 PCR 与纳米孔扩增子测序| |15|GRADE|Grading of Recommendations Assessment, Development and Evaluation|推荐分级、评估、制定与评价系统| |16|ICU|Intensive care unit|重症监护病房|

10

海军军医大学学报

|17|Indel|Insertion/deletion|插入/缺失| |---|---|---|---| |18|LDT|Laboratory developed test|实验室自建检测项目| |19|MTB|Mycobacterium tuberculosis|结核分枝杆菌| |20|NCBI|National Center for Biotechnology Information|美国国家生物技术信息中心| |21|NGDC|National Genomics Data Center|国家基因组科学数据中心| |22|NGS|Next-generation sequencing|二代测序| |23|NTC|No template control|无模板对照| |24|PCR|Polymerase chain reaction|聚合酶链反应| |25|PoN|Panel of normals|正常对照样本集| |26|POCT|Point-of-care testing|床旁检测| |27|qPCR|Quantitative PCR|定量 PCR| |28|RPA|Recombinase polymerase amplification|重组酶聚合酶扩增| |29|SARS-CoV-2|Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2|严重急性呼吸综合征冠状病毒2| |30|SILVA|SILVA database|SILVA 数据库| |31|SMA|Spinal muscular atrophy|脊髓性肌萎缩症| |32|SNV|Single nucleotide variant|单核苷酸变异| |33|STR|Short tandem repeat|短串联重复序列| |34|SV|Structural variant|结构变异| |35|TAT|Turn-around Time|周转时间| |36|TB|Tuberculosis|结核病| |37|VAF|Variant allele frequency|变异等位基因频率| |38|VISA|Vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus|万古霉素中介金黄色葡萄球菌| |39|VME|Very major error|极大错误| |40|WES|Whole exome sequencing|全外显子组测序| |41|WGS|Whole genome sequencing|全基因组测序| |||共识编写专家委员会|| |||组织编写中国医药生物技术协会生物诊断技术分会|| |||中国医师协会检验医师分会临床分子诊断学组|| |||中国医师协会精准医学专业委员会|| |||顾问专家|| |王红阳|中国工程院院士,海军军医大学国家肝癌科学中心||| |贾伟平|中国工程院院士,上海交通大学医学院||| |王健伟|中国工程院院士,中国疾病预防控制中心/中国预防医学科学院|||

《纳米孔测序技术创新与规范化应用专家共识(年)》编写专家委员会等 纳米孔测序技术创新与规范化应用专家共识(2025年)

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|专家委员会| |---| |文文 海军军医大学第三附属医院(东方肝胆外科医院)| |黄亿华中国科学院生物物理研究所| |刘善荣海军军医大学第一附属医院(长海医院)| |王辉 北京大学人民医院| |周洲 中国医学科学院阜外医院| |肖传乐中山大学中山眼科中心| |专家组成员(按姓氏笔画排序)| |王升启军事科学院军事医学研究院| |白净卫清华大学药学院| |刘家云空军军医大学第一附属医院(西京医院)| |应斌武四川大学华西医院| |汪德鹏复旦大学生命科学学院基因技术教育部工程研究中心| |宋宏彬解放军疾病预防控制中心| |杜鲁涛山东大学第二医院| |陈鸣 陆军军医大学第一附属医院(西南医院)| |李鹏 解放军疾病预防控制中心| |张晓鹏军事科学院军事医学研究院| |周宏伟南方医科大学深圳医院| |赵翔 中国疾病预防控制中心国家流感中心| |顾兵 广东省人民医院检验科/广东省临床检验中心| |秘书组| |曹琦琪海军军医大学第三附属医院(东方肝胆外科医院)| |宋广涛北京生物岛实验室| |黄威翰海军军医大学第三附属医院(东方肝胆外科医院)|

秘书组

|曹琦琪海军军医大学第三附属医院(东方肝胆外科医院)| |---| |宋广涛北京生物岛实验室| |黄威翰海军军医大学第三附属医院(东方肝胆外科医院)|

[参考文献]

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References

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推荐意见与 GRADE 证据分级

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